雷帕霉素、FK506對大鼠雪旺細(xì)胞增殖、遷移及相關(guān)蛋白表達(dá)影響的對比研究.pdf

1、目的：研究大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑雷帕霉素、FK506對周圍神經(jīng)再生的促進(jìn)作用，通過觀察兩者在不同濃度下對體外培養(yǎng)的大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖、遷移及對大鼠雪旺氏細(xì)胞周期、相關(guān)蛋白(ERK,p-ERK,NCAM;GAP43)和神經(jīng)生長因子（NGF）的影響，對比分析兩者對雪旺氏細(xì)胞的生長促進(jìn)作用及其差異，為大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑治療周圍神經(jīng)損傷提供一定的理論依據(jù)。
　　方法：1.選擇純化的大鼠雪旺氏細(xì)胞，將其分為FK506組、雷帕霉素組、溶劑組

2、，而FK506組及雷帕霉素組分別分為1.53 nM、6.1 nM、24.4 nM、97.6 nM、390 nM、1.56microM、6.25microM、25microM、100 microM10個劑量組。與大鼠雪旺氏細(xì)胞分別培養(yǎng)6h、12h、24h、36h、48h、60h和72h。在熒光顯微鏡下觀察大鼠雪旺氏細(xì)胞的生長情況，并用MTT法檢測其不同時間點(diǎn)的OD值；2.用流式細(xì)胞儀檢測雷帕霉素及 FK506對體外培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞周期的影響

3、；3.采用細(xì)胞劃痕的方法檢測雷帕霉素及FK506對體外培養(yǎng)雪旺氏細(xì)胞遷移的影響；4.選擇純化的大鼠雪旺氏細(xì)胞，用FK506(6.25microM,100 microM)和雷帕霉素（25microM、1.53nM）及溶劑對照組分別培養(yǎng)48h。采用蛋白免疫印跡（Westcrn Blot）、免疫沉淀的測定方法研究雷帕霉素對雪旺氏細(xì)胞ERK,p-ERK,GAP43,NCAM蛋白表達(dá)的影響。5.選擇純化的大鼠雪旺氏細(xì)胞，用FK506(6.25mi

4、croM,100 microM)和雷帕霉素（25microM、1.53nM）及溶劑對照組分別培養(yǎng)48h。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA法）測定雷帕霉素對雪旺氏細(xì)胞NGF分泌的影響。
　　結(jié)果：1.FK506對大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖作用呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，隨著劑量的加大，其對大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖作用越明顯，F(xiàn)K5066.25microM劑量組大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖作用表現(xiàn)最優(yōu)(P<0.05)；當(dāng) FK506劑量加大到400micr

5、oM后，其對大鼠雪旺氏細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用，大鼠雪旺氏細(xì)胞出現(xiàn)活性下降甚至凋亡，與其他 FK506有明顯性差異（P<0.006）；而雷帕霉素對大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖作用沒有劑量依賴性，隨著劑量的加大，其對大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖促進(jìn)作用未見增大，其在小劑量1.53nM就可以明顯促進(jìn)大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖（P<0.05），當(dāng)其劑量加大到100microM后，其對大鼠雪旺氏細(xì)胞表現(xiàn)出一定的毒性作用，大鼠雪旺氏細(xì)胞出現(xiàn)活性下降甚至凋亡,與其他雷帕

6、霉素治療組有明顯性差異（P<0.005）。2. FK506劑量組及雷帕霉素劑量組均可以使大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖指數(shù)及S期增大，其中以FK506劑量組使大鼠雪旺氏細(xì)胞的增殖指數(shù)及 S期增大較為明顯，與雷帕霉素劑量組及溶劑對照組有明顯差異（p<0.05）。3.無論是FK506劑量組還是雷帕霉素劑量組均能促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的遷移，與溶劑對照組有明顯的差異(p<0.006)。其中雷帕霉素劑量組促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞遷移的效果最佳，其與FK506劑量組有明顯差

7、異(p<0.05)。4. FK506及雷帕霉素劑量組對大鼠雪旺氏細(xì)胞ERK及p-ERK蛋白的表達(dá)較溶劑對照組變化不明顯（P>0.05）；但是其均可以促進(jìn)大鼠雪旺氏細(xì)胞NCAM（P<0.01）和GAP43(P<0.01)的表達(dá),其中雷帕霉素是較 FK506劑量組明顯升高（NCAM P<0.05）和 GAP43 P<0.05）。5.分別加入FK506、雷帕霉素及溶劑48h后，F(xiàn)K506-100 microM劑量組及雷帕霉素-1.53nM劑量

8、組 NGF分泌量較其他組明顯升高（p<0.05）。但是FK506-100 microM劑量組與雷帕霉素-1.53nM劑量組兩組之間比較無明顯差異（p>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.雷帕霉素、FK506均具有促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞增殖的能力，且FK506促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞增殖的能力強(qiáng)于雷帕霉素，雷帕霉素的最優(yōu)濃度為1.53nM；FK506最優(yōu)濃度為6.25microM。
　　2.雷帕霉素、FK506均具有促進(jìn)雪旺氏細(xì)胞的遷移的能