FK506對中期保存離體角膜作用機制研究.pdf

1、背景：隨著器官移植技術(shù)的發(fā)展，離體器官的保存也越來越受到重視，離體器官的保存質(zhì)量直接影響移植后器官的成活率及其成活后的功能，器官保存技術(shù)是近幾十年的研究熱點之一。 研究證明離體器官損傷有多種機制參與，如氧自由基損傷、基因調(diào)控的細胞凋亡等。有研究證明在器官保存液中加入氧自由基清除劑或抑制氧自由基生成的物質(zhì)，或明顯提高離體器官的存活時間，提高移植成功率，降低缺血再灌注損傷。 FK506是一種從霉菌中分離的大環(huán)內(nèi)脂類抗生素，也

2、是一種新合成的高效器官移植免疫劑。據(jù)研究報道，F(xiàn)K506可增強組織低溫保存再灌注的血流，增加組織ATP含量，可減少再灌注組織中的氧自由基含量，減低細胞因子和釋放和中性粒細胞的浸潤能力，抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生，從而減輕組織損傷。也有研究證明利用FK506預處理移植物，可明顯降低移植物凋亡率，保護組織細胞線粒體，其機理仍在研究中。 角膜移植手術(shù)是目前最常見，成功率最高的器官移植手術(shù)，但免疫排斥反應依就是角膜移植失敗的主要原因

3、。臨床上目前采用的皮質(zhì)類固醇，環(huán)孢霉素A、絲裂霉素C等免疫抑制劑等，可以有效地防治免疫排斥反應。FK506目前已廣泛用于各種器官移植及各類自身免疫性疾病的治療，在抑制角膜移植免疫排斥反應方面有廣泛的應用。近年研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)K506在離體器官的保存方面也有重要的保護作用，可以明顯降低離體器官細胞凋亡，延長離體器官保存時間，但FK506在離體角膜的保存的保護作用及其機制國內(nèi)尚未見報道。 BCL-2基因是目前最受關(guān)注的并被確認的的調(diào)亡抵

4、制基因，其基因產(chǎn)物通過抵抗線粒體釋放促凋亡蛋白、維持細胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定、對抗脂質(zhì)過氧化反應及抑制富含胱氨酸蛋白酶的激活等作用抑制細胞的凋亡。BCL-2富含于線粒體膜上，具有維護線粒體膜的完整性及生理通透性的重要作用，對細胞凋亡有明顯的抑制作用。@ 本研究對FK506對離體角膜的保護作用及其機制進行探索，并通過BCL-2蛋白的表達情況對FK506對離體角膜保護的機理進行研究。 目的：探討FK506在中期角膜保存過程中對角膜細胞形態(tài)

5、的影響，以減少角膜保存過程中保存角膜細胞的價值，為改良角膜保存液，延長離體角膜保存時間提供實驗室依據(jù)。 研究以免疫組織化學染色法觀察BCL-2蛋白在離體角膜組織的表達，研究FK506對離體角膜保護的機理。 方法：收集質(zhì)量相近身體健康的新西蘭大白兔24只，耳緣靜脈栓塞致死，完整取下眼球，每只兔的右眼做為試驗組共24只置于4℃冰箱保存的，由山東省眼科研究所生產(chǎn)的角膜保存液中，每只兔的左眼共24只做為對照組置于同樣的、同時生產(chǎn)

6、的角膜保存液中，實驗組中保存液含有0.3mg/L濃度的FK506。 分別于4、6、8天每組隨機取4只眼球并取帶2mm鞏膜環(huán)的角膜片，經(jīng)30-34℃2h復溫，固定切片，置預冷的10％福爾馬林液中固定，石蠟包埋，行角膜切片，切片厚4μm, HE染色。觀察細胞形態(tài)。 于4、6、8天每組隨機抽取4只眼球并取帶2mm鞏膜環(huán)的角膜片分別行半定量RT-PCR法觀察BCL-2 mRNA表達水平和S-P免疫組化法觀察角膜細胞BCL-2蛋白

7、的表達水平。BCL-2蛋白免疫組化以顯微鏡下胞漿染成棕黃色為陽性細胞：將染色分為4級：0=陰性染色、1=弱陽性染色、2：中度陽性染色、3=強陽性染色，將各組染色分級量化后進行統(tǒng)計學分析，各組BCL-2蛋白表達差異用單因素方差分析等統(tǒng)計學方法進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果：HE染色試驗組較對照組保存角膜水腫較輕，被褶較少透明度較高，角膜細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)較好。 半定量RT-PCR法檢測BCL-2 mRNA表達，4天試驗組BCL-2mRN

8、A表達與對照組無明顯統(tǒng)計學差異．(P>0.05)；6天試驗組、BCL-2 mRNA表達高于對照組的有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；8天試驗組BCL-2 mRNA表達高于對照組的有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。 免疫組化測定角膜內(nèi)皮細胞BCL-2蛋白的表達，BCL-2蛋白免疫組化以顯微鏡下胞漿染成棕黃色為陽性細胞，4天試驗組BCL-2蛋白表達與對照組無明顯統(tǒng)計學差異(P>0.05)；6天試驗組BCL-2蛋白表達高于對照組的有顯著統(tǒng)計學