開心散治療CMS抑郁模型大鼠的作用機(jī)制及活性成分TenuifolisideA基于ERK和PI3K通路介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制研究.pdf

1、開心散始載于唐代孫思邈之《備急千金要方》，是治療中醫(yī)情志病的經(jīng)典方，由人參、遠(yuǎn)志、茯苓、石菖蒲4味藥組成。其方主治心氣不定，五臟不足，憂愁悲傷不樂，忽忽喜忘，朝愈暮劇，或暮愈朝發(fā)等情志異常，類似于西醫(yī)的抑郁，焦慮，學(xué)習(xí)記憶障礙等。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，開心散中遠(yuǎn)志寡糖酯類是中藥復(fù)方抗抑郁的主要活性部位，其活性單體Tenuifoliside A(TFSA)可通過增加新生細(xì)胞合成DNA而減輕皮質(zhì)酮對SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞的損傷，可明顯增加

2、慢性應(yīng)激所致抑郁模型動(dòng)物海馬中磷酸化環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(phospho-cAMP response element binding protein，p-CREB)和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的表達(dá)量，并能調(diào)節(jié)慢性應(yīng)激大鼠HPA軸的功能，有明顯的抗抑郁樣作用。
　　目前，抑郁神經(jīng)營養(yǎng)假說認(rèn)為BDNF分泌減少或與BDNF相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路受損是抑郁癥發(fā)生的

3、關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。 BDNF結(jié)合高親和力受體酪氨酸激酶B(tyrosine kinase B，TrkB)后可激活細(xì)胞內(nèi)多條信號通路，其中ERK和PI3K信號通路是研究抗抑郁藥物作用機(jī)制的重要靶標(biāo)。
　　本研究包括兩部分內(nèi)容:首先，在經(jīng)典的抑郁動(dòng)物模型（慢性溫和應(yīng)激模型）上檢測抑郁動(dòng)物BDNF/TrkB信號系統(tǒng)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白(TrkB，ERK，CREB，PI3K，Akt，GSK3β，BDNF)的變化，以及采用經(jīng)典古方開心散治療抑郁后，對B

4、DNF/TrkB信號通路關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)蛋白的影響，探索開心散抗抑郁作用的分子機(jī)制。其次，以開心散中的活性成分寡糖酯類單體化合物TFSA為研究對象，建立皮質(zhì)酮(Corticosterone，CORT)損傷體外神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞模型以及原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元模型，評價(jià)TFSA的神經(jīng)保護(hù)作用，并根據(jù)抑郁癥發(fā)病機(jī)制的新理論，采用化學(xué)拮抗劑阻斷方法從BDNF/TrkB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路闡明TFSA抗抑郁的細(xì)胞分子機(jī)制。
　　在孤養(yǎng)結(jié)合慢性溫和應(yīng)激(CMS)大鼠

5、抑郁模型上，作者觀察抑郁動(dòng)物腦中TrkB/BDNF/ERK和TrkB/BDNF/PI3K信號通路中關(guān)鍵蛋白(TrkB，p-ERK，p-CREB，PI3K，Akt，p-GSK3β，BDNF)表達(dá)的變化，以及采用經(jīng)典古方開心散治療后，對抑郁動(dòng)物腦中關(guān)鍵蛋白的影響，以期揭示開心散抗抑郁作用的分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，慢性應(yīng)激5周后，抑郁大鼠海馬和前額皮層中TrkB受體水平及BDNF表達(dá)量均明顯降低，PI3K，Akt，p-ERK蛋白水平亦同時(shí)降低

6、，給予370mg·kg-1的開心散治療2周后，即能改善由慢性應(yīng)激所致的低TrkB受體水平;并能明顯促進(jìn)CMS大鼠海馬中p-CREB，p-ERK，PI3K，Akt及BDNF蛋白的表達(dá)，但未能增加p-GSK3β蛋白的水平;同時(shí)開心散還可促進(jìn)CMS大鼠前額皮層中p-ERK，p-CREB及BDNF蛋白的表達(dá)。本部分研究證明TrkB/BDNF信號通路在抑郁癥的病理生理和抗抑郁作用機(jī)制上起重要作用，顯示BDNF表達(dá)與抑郁癥呈負(fù)關(guān)聯(lián)關(guān)系，進(jìn)一步驗(yàn)證了

7、抑郁的神經(jīng)營養(yǎng)假說。同時(shí)提示我們，開心散對抑郁模型大鼠抗抑郁治療的分子機(jī)制是通過激活TrkB/BDNF信號系統(tǒng)中ERK和PI3K通路，促進(jìn)關(guān)鍵蛋白TrkB，ERK，CREB，PI3K和Akt的磷酸化來上調(diào)BDNF的表達(dá)。
　　在體外研究中，作者采用CORT模擬體內(nèi)高CORT環(huán)境誘導(dǎo)損傷大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（C6細(xì)胞），觀察TFSA(30、10和3μmol·L-1)和地昔帕明(Desipramine，DIM，5μmol·L-1)對受損

8、C6細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用;檢測TFSA對CORT誘導(dǎo)C6細(xì)胞損傷的存活率影響、Hoechst33258染核后細(xì)胞凋亡形態(tài)變化、細(xì)胞內(nèi)ERK及凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)以及Caspase-3激酶活力的變化。結(jié)果顯示，與對照組比，0.8mmol·L-1的CORT對C6細(xì)胞有明顯的損傷作用，其細(xì)胞存活率降低至69.58％;細(xì)胞核形態(tài)改變，出現(xiàn)凋亡小體;胞內(nèi)ERK蛋白和抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量明顯降低(P＜0.01)，而促凋亡蛋白Ba

9、x的表達(dá)和Caspase-3激酶活力增加(P＜0.01)。與模型組相比，TFSA各劑量組均有不同程度對抗CORT損傷的作用，細(xì)胞存活率提高至84.48％，細(xì)胞核形態(tài)有明顯改善，和DIM組相比沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同時(shí)細(xì)胞內(nèi)的ERK和Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯增加(P＜0.01); Bax蛋白和Caspase-3激酶活力降低（P＜0.05）。表明TFSA對CORT誘導(dǎo)損傷的C6細(xì)胞具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與TFSA激活C6細(xì)胞內(nèi)ERK通路，提高抗

10、凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，降低促凋亡蛋白Bax和Caspase-3激酶活性有關(guān)。
　　為進(jìn)一步研究TFSA的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制，作者研究了TFSA對C6細(xì)胞BDNF表達(dá)的影響，并設(shè)置一系列時(shí)間點(diǎn)(0，2，5，7，10，15，30，45，60min)考察TFSA誘導(dǎo)TrkB/BDNF/ERK和TrkB/BDNF/PI3K信號通路中關(guān)鍵蛋白磷酸化過程;同時(shí)采用TrkB受體拮抗劑(K252a)，ERK拮抗劑(U0126)和PI3K拮抗劑(L

11、Y294002)預(yù)先拮抗C6細(xì)胞再以TFSA干預(yù)，檢測拮抗前后以上信號通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，TFSA(6，10和30μmol·L-1)劑量組能明顯促進(jìn)C6細(xì)胞增殖(P＜0.01)且無明顯細(xì)胞毒性，并能誘導(dǎo)C6細(xì)胞內(nèi)BDNF的表達(dá)呈劑量依賴性;同時(shí)，10μmol·L-1的TFSA可在不同的時(shí)間點(diǎn)上誘導(dǎo)蛋白磷酸化，其中ERK，CREB和GSK3β的磷酸化水平變化明顯;在用拮抗劑預(yù)處理后，TFSA誘導(dǎo)關(guān)鍵蛋白(Tr

12、kB，ERK，CREB，PI3K，Akt和GSK3β)的磷酸化作用被不同程度拮抗，并且拮抗后BDNF的表達(dá)水平也明顯降低(P＜0.01)。綜合以上研究結(jié)果，表明TFSA的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與激活TrkB/BDNF信號系統(tǒng)介導(dǎo)的ERK和PI3K通路，促進(jìn)ERK和Akt磷酸化后進(jìn)而促進(jìn)下游CREB和GSK3β的磷酸化，最終促進(jìn)BDNF表達(dá)有關(guān)。
　　作者在原代培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元模型上考察了TFSA的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。體外培養(yǎng)新生12h內(nèi)的S

13、D大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞7天后，以不同濃度TFSA(1，3，10和30μmol·L-1)及BDNF(25pg·L-1)處理海馬神經(jīng)元細(xì)胞，檢測TFSA對神經(jīng)元存活率和BDNF表達(dá)量的影響;并采用TrkB受體拮抗劑預(yù)處理海馬神經(jīng)元，再以TFSA干預(yù)，檢測p-TrkB，TrkB，p-ERK，ERK和BDNF蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，TFSA(1，3和10μmol·L-1)劑量組海馬神經(jīng)元存活率明顯升高;TFSA對BDNF表達(dá)量呈現(xiàn)

14、濃度和時(shí)間依賴性，在6h時(shí)BDNF表達(dá)量明顯升高，且10μmol·L-1的TFSA能明顯促進(jìn)BDNF的釋放（和對照組相比，P＜0.01），同時(shí)海馬神經(jīng)元中p-TrkB和p-ERK的表達(dá)水平也明顯升高;加入K252a預(yù)處理后，ERK和TrkB的磷酸化作用被阻斷，BDNF的表達(dá)量也低于單用TFSA處理組(P＜0.01)。上述研究結(jié)果提示，TFSA可以促進(jìn)大鼠海馬神經(jīng)元存活，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與激活TrkB/ERK/BDNF通路促進(jìn)

15、ERK磷酸化有關(guān)。
　　綜上，本研究論文從動(dòng)物水平上驗(yàn)證了開心散的抗抑郁作用，發(fā)現(xiàn)開心散抗抑郁作用的分子機(jī)制是通過上調(diào)腦內(nèi)BDNF及TrkB受體表達(dá)來激活TrkB-BDNF信號系統(tǒng)，在海馬中同時(shí)介導(dǎo)ERK和PI3K信號通路，而在前額皮層則主要介導(dǎo)ERK信號通路對腦神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)作用。作者進(jìn)一步在C6細(xì)胞株和原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞水平上證明了開心散中活性成分TFSA的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制與激活TrkB/BDNF介導(dǎo)的ERK和PI3K信號通路，