滋陰中藥活性成分對神經(jīng)退行性疾病的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）和帕金森病(Parkinson's disease，PD)是好發(fā)于老年人最常見的神經(jīng)退行性疾病。AD主要病理特征是基底核膽堿能神經(jīng)元變性丟失，PD則是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的退行性變性丟失等。神經(jīng)營養(yǎng)因子，特別是腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Glial cell line-derived

2、 neurotrophic factor，GDNF)對于神經(jīng)元的存活、生長發(fā)育具有重要作用。開發(fā)誘導(dǎo)內(nèi)源性BDNF/GDNF表達(dá)的小分子化合物已成為神經(jīng)退行性疾病藥物治療的一個研究熱點(diǎn)。因此，本課題主要研究滋陰中藥活性成分哈巴俄苷(harpagoside，HAR)和異菝葜皂苷元（Smilagenin，SMI）在神經(jīng)退行性疾病中的作用，探討是否與誘導(dǎo)BDNF/GDNF蛋白表達(dá)有關(guān)，從而闡明他們改善神經(jīng)退行性疾病的共性。
　　第一部分

3、實(shí)驗(yàn)，通過構(gòu)建擬AD大鼠模型，從在體和離體兩個層面研究HAR對擬AD模型的神經(jīng)保護(hù)作用，并對相關(guān)機(jī)制進(jìn)行探討。
　　在體實(shí)驗(yàn)，通過雙側(cè)海馬立體定位注射Aβ1-40，構(gòu)建擬AD大鼠模型。喂服HAR60天后，首先進(jìn)行相關(guān)行為學(xué)測試，用曠場試驗(yàn)評價大鼠運(yùn)動功能，新物體識別實(shí)驗(yàn)和Y-迷宮實(shí)驗(yàn)評價學(xué)習(xí)記憶功能。行為學(xué)分析顯示，與假手術(shù)對照組相比，Aβ?lián)p傷的模型組大鼠學(xué)習(xí)記憶功能明顯下降;HAR治療能夠改善其學(xué)習(xí)記憶功能;各組大鼠的運(yùn)動功能沒

4、有差異。接著用ELISA和Westernblot方法觀察HAR對BDNF及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)HAR能夠上調(diào)模型組大鼠內(nèi)嗅皮層、海馬組織下降的BDNF蛋白表達(dá)，提高其皮層、海馬組織p-ERK與ERK、p-AKT與AKT的比值。提示HAR能夠誘導(dǎo)BDNF蛋白表達(dá)以及激活ERK、AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。最后觀察HAR對突觸蛋白的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)突觸蛋白含量在各組大鼠皮層、海馬組織中均無明顯差異。
　　離體實(shí)驗(yàn)，采用Aβ1-

5、42損傷原代皮層神經(jīng)元作為擬AD細(xì)胞模型。首先，研究HAR對皮層神經(jīng)元的保護(hù)作用。結(jié)果顯示HAR預(yù)保護(hù)24h能劑量依賴性的提高Aβ?lián)p傷細(xì)胞的存活率（MTT分析），提高ChAT陽性神經(jīng)元的數(shù)目及軸突長度（免疫細(xì)胞化學(xué)分析）。提示HAR能夠保護(hù)膽堿能神經(jīng)元免于Aβ?lián)p傷。Western blot結(jié)果顯示HAR提高Aβ?lián)p傷組p-ERK/ERK、p-AKT/AKT的值。最后，對HAR的機(jī)制進(jìn)行研究。阻斷BDNF后，發(fā)現(xiàn)HAR提高Aβ?lián)p傷細(xì)胞存活率

6、的能力以及保護(hù)ChAT陽性神經(jīng)元的作用被全部或者部分抑制，提示HAR發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能是通過上調(diào)BDNF蛋白表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)SMI對老年大鼠學(xué)習(xí)記憶功能有影響，第二部分實(shí)驗(yàn)主要研究SMI對老年大鼠多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)退行性改變和運(yùn)動功能的影響。以青年和老年大鼠為研究對象，老年大鼠給予灌胃SMI60天后能夠顯著改善老年大鼠的運(yùn)動功能（曠場試驗(yàn)和Rotarod行為學(xué)測試）、增加黑質(zhì)致密部酪氨酸羥化酶(TH)陽性神經(jīng)元數(shù)目

7、（免疫組織化學(xué)染色和立體計(jì)數(shù)）、提高紋狀體多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體密度（放射自顯影測定）和腦內(nèi)多巴胺受體(D1、D2R)密度（放射配基結(jié)合分析）。同時，SMI能提高老年大鼠下降的GDNF蛋白含量(ELISA)。
　　綜上所述，我們首次證實(shí)HAR可能通過上調(diào)BDNF蛋白表達(dá)及激活下游MAPK/PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)膽堿能神經(jīng)元的存活及軸突生長，從而改善擬AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。本研究還發(fā)現(xiàn)SMI可能是通過上調(diào)GDNF蛋白表達(dá)，保護(hù)老年大鼠中