轉(zhuǎn)錄后調(diào)控SOD1增加腫瘤細(xì)胞放射效應(yīng)影響的研究.pdf

1、目的:目前克服腫瘤細(xì)胞放射抗拒性策略較多,但效果欠佳。研究發(fā)現(xiàn)SOD1高表達(dá)是腫瘤對(duì)放化療抵抗的重要機(jī)制之一,但SOD1高表達(dá)的機(jī)制不明?；虮磉_(dá)的精細(xì)調(diào)控多與3’UTR的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān),但關(guān)于腫瘤SOD1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控報(bào)道較少,因此本課題擬探討腫瘤SOD1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制及其對(duì)腫瘤反射效應(yīng)的影響,為以SOD1為靶標(biāo)的放療增敏策略提供理論基礎(chǔ)。
　　方法:本課題主要以卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780和胰腺癌PANC1為模型,(1)構(gòu)建SOD-3

2、’UTR的熒光素酶報(bào)告載體,觀察SOD1、SOD2-3’UTR在腫瘤細(xì)胞對(duì)熒光素酶活性的影響,以及在過氧化氫和X射線作用下的變化;并應(yīng)用RT-PCR和蛋白印跡法驗(yàn)證腫瘤細(xì)胞在過氧化氫作用下SOD1mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。
　　(2)比較SOD1-3’UTR在兩種腫瘤細(xì)胞中對(duì)熒光素酶活性的影響,并應(yīng)用 RT-PCR法檢測(cè)螢火素酶mRNA的水平;并進(jìn)一步應(yīng)用蛋白印跡法觀察外源SOD-3’UTR對(duì)內(nèi)源性SOD蛋白表達(dá)的影響。構(gòu)建不

3、同的SOD1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體,包括含有不同AREs的、miRNA(miR-224、-377、-621)結(jié)合位點(diǎn)缺失的、單個(gè)或多個(gè)AREs聯(lián)合缺失的3’UTR載體,或應(yīng)用miRNA的擬似物或抑制劑等觀察RNA元件對(duì)3-‘UTR所介導(dǎo)的熒光素酶性的影響,或SOD1蛋白表達(dá)的變化。構(gòu)建SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體,進(jìn)一步對(duì)該載體進(jìn)行AREs缺失突變,檢測(cè)X射線處理后熒光素酶活性的變化。
　

4、　(3)RNA干擾技術(shù)下調(diào)AUF1或外源真核表達(dá)上調(diào)AUF1,觀察其對(duì)SOD1蛋白表達(dá)的變化;以及SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的變化;并觀察AUF1下調(diào)對(duì)腫瘤細(xì)胞ROS水平的影響;進(jìn)一步應(yīng)用RNA免疫共沉淀檢測(cè)AUF1與SOD1-3’UTR的直接作用;免疫組化法檢測(cè)胰腺癌標(biāo)本中AUF1和SOD1蛋白的表達(dá)。
　　結(jié)果:(1)SOD1、SOD2-3’UTR正義載體與反義載體相比,熒光素酶活性增加近20倍;過氧化氫100μ

5、M明顯增加了A2780細(xì)胞內(nèi)SOD1、SOD2-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;10Gy射線明顯增加了A2780細(xì)胞內(nèi)SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;過氧化氫100μM增加了A2780細(xì)胞SOD1mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　(2)在A2780和PANC1細(xì)胞內(nèi)SOD1-3’UTR正義載體相比反義、空載體的熒光素酶活性明顯增加;SOD1-3’UTR增加了A2780細(xì)胞螢火素酶mRNA的水平;外源SOD-3’UTR降低了A

6、2780細(xì)胞內(nèi)源性SOD蛋白的表達(dá),并且外源SOD1-3’UTR能降低內(nèi)源性SOD2蛋白的表達(dá);逐步的對(duì)SOD1-3’UTR作片段的截?cái)嗪蠼Y(jié)果顯示熒光素酶活性也逐漸降低;miR-224,miR-377結(jié)合位點(diǎn)的缺失導(dǎo)致熒光素酶活性顯著下降,而miR-621結(jié)合位點(diǎn)的缺失未見明顯變化;miR-377或miR-621的擬似物或抑制劑并沒有顯著影響內(nèi)源性SOD1的表達(dá),也沒有影響SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性;任一個(gè)ARE的缺失均能

7、降低熒光素酶活性,以ARE6的作用最強(qiáng);但當(dāng)載體僅包含2個(gè)或4個(gè)ARE本身的序列時(shí)熒光素酶活性幾乎測(cè)不出。ARE6的缺失逆轉(zhuǎn)了X射線誘導(dǎo)的SOD1-Promoter-SOD1-3’UTR所介導(dǎo)的熒光素酶活性的增加。
　　(3)AUF1的下調(diào)明顯降低了SOD1蛋白的表達(dá)水平,而HuR的下調(diào)對(duì)SOD1蛋白表達(dá)的影響不大,并與熒光素酶活性的結(jié)果一致;AUF1的高表達(dá)增加了這兩種細(xì)胞系內(nèi)的SOD1-3’UTR介導(dǎo)的熒光素酶活性;RT-PC

8、R法僅能從AUF1沉淀物中檢測(cè)到SOD1-3’UTR的表達(dá);93例胰腺癌組織標(biāo)本檢測(cè)的結(jié)果顯示AUF1和SOD1的蛋白表達(dá)明顯相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)SOD1-3’UTR與腫瘤細(xì)胞基礎(chǔ)和應(yīng)激狀態(tài)下SOD1的表達(dá)相關(guān)。
　　(2)SOD1-3’UTR能增加腫瘤細(xì)胞SOD1mRNA的穩(wěn)定性,并與ARE特別是ARE6相關(guān),與所檢測(cè)的miRNA結(jié)合位點(diǎn)相關(guān)的可能性不大。
　　(3)AUF1通過與SOD1-3’UTR結(jié)合影響腫瘤