Fe3O4納米粒細胞內(nèi)熱療增加腫瘤放射敏感性的研究.pdf

1、本文分兩個部分進行探討：
　　第一部分:Fe3O4納米粒的合成與修飾
　　目的：①通過對Fe3O4納米粒的合成方法進行優(yōu)化及包裹修飾，增加Fe3O4納米粒在電解質(zhì)溶液中的穩(wěn)定性、分散性及生物相容性；②檢測Fe3O4納米粒在腫瘤細胞中的攝取作用及細胞毒性，為其后續(xù)研究打下基礎。
　　方法：①應用熱分解法制備Fe3O4納米粒，分別對其進行TiO2，DSPE-mpeg，PAA包裹修飾；②應用粒度儀檢測其水合粒徑大小及分散性，

2、透射電子顯微鏡檢測其粒徑及分布，XRD測定其元素及構型，VSM測定其磁性特征；③對納米粒進行熒光修飾，通過細胞攝取實驗，應用共聚焦顯微鏡檢測其在細胞中的分布，并通過光鏡及透射電子顯微鏡印證納米粒在細胞中的分布。④紅外溫度計測定不同濃度下Fe3O4@PAA納米粒在交變磁場下的升溫情況，明確其產(chǎn)熱作用；⑤將梯度濃度的Fe3O4@PAA納米粒與腫瘤細胞共同孵育24h，檢測細胞內(nèi)攝取的納米粒的質(zhì)量。⑥納米粒鼠尾靜脈注射H22鼠源性肝癌移植瘤模型

3、，HE染色觀察小鼠主要器官中納米粒的分布；⑦應用MTT法檢測其對腫瘤細胞的毒性。
　　結果：①XRD顯示應用熱分解法制備的Fe3O4納米粒高度和位置與JCPDS(粉末衍射標準聯(lián)合會)數(shù)據(jù)庫卡片(JCPDS19-0629)中的Fe3O4磁性納米粒子結果一致。其粒徑為8-10nm，VSM測得飽和磁化強度為18emu/g。分別進行修飾后Fe3O4@TiO2、Fe3O4@DSPE-mpeg、Fe3O4@PAA粒徑分別為：260nm，120

4、nm，68nm；三者飽和磁化強度分別為：12emu/g,42emu/g,12emu/g；根據(jù)上述結果選擇Fe3O4@PAA納米粒作為進一步實驗的材料。②光鏡、共聚焦顯微鏡及透射電子顯微鏡均可觀察到Fe3O4@PAA納米粒在細胞質(zhì)中分布。③納米粒在500kHZ交變磁場下，隨著時間的延長，濃度越高，溫度升高的越快，30min內(nèi)溫度升高較快，之后升高速度明顯變慢。④隨著納米粒濃度的升高，細胞內(nèi)攝取的納米粒并不隨之升高，細胞內(nèi)攝取的納米粒約為2

5、0ug。⑤成功建立了H22鼠源性肝癌動物模型，鼠尾靜脈注射納米粒后其主要分布在腫瘤組織中，脾臟中也發(fā)現(xiàn)有納米粒，肺臟、肝臟組織中均未發(fā)現(xiàn)納米粒。⑥MTT法實驗結果顯示Fe3O4@PAA納米粒在50-800ug/ml濃度范圍內(nèi)對大細胞肺癌細胞H460，鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-1均無明顯抑制作用。
　　結論：①本實驗應用熱分解法成功制備了Fe3O4納米粒，并成功對其進行了修飾：Fe3O4@TiO2、Fe3O4@DSPE-mpeg

6、、Fe3O4@PAA，通過檢測，證明Fe3O4@PAA納米材料在粒徑、分散性、穩(wěn)定性、超順磁性及可修飾性等綜合評價中最適合進一步的生物醫(yī)學實驗。②細胞攝取實驗表明納米粒主要分布于細胞質(zhì)中。③通過納米粒攝取效率實驗及升溫實驗間接證明了納米粒的細胞內(nèi)熱療；④鼠尾靜脈注射實驗表明納米粒具有EPR效應，且其主要分布在腫瘤組織中；⑤MTT毒性實驗表明制備的Fe3O4@PAA納米粒對大細胞肺癌細胞H460，鼻咽癌細胞CNE-2、HNE-1均無明顯毒

7、性。
　　第二部分:交變磁場下Fe3O4納米粒細胞內(nèi)熱療增加腫瘤放射敏感性
　　目的：①Fe3O4@PAA納米粒被腫瘤細胞吞噬，在交變磁場作用下對腫瘤細胞進行細胞內(nèi)熱療，聯(lián)合放射治療，檢測其對腫瘤細胞的殺傷作用，探討其在腫瘤放射增敏中的應用及初步機制。②將Fe3O4@PAA納米粒進行鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤瘤體內(nèi)注射，在交變磁場下進行熱療，聯(lián)合放療作用，測量瘤體體積，探討其對鼻咽癌細胞裸鼠移植瘤的放射增敏作用。
　　方法：

8、①MTT法檢測納米粒在交變磁場下及聯(lián)合放療對H460、CNE-2及HNE-1三種腫瘤細胞增殖的抑制作用；②克隆形成實驗檢測納米粒在交變磁場下細胞內(nèi)熱療對三種腫瘤細胞的放射增敏作用；③Western-blot實驗檢測三種腫瘤細胞在經(jīng)過處理后其HSP70及caspase-3蛋白的表達變化；④流式細胞術 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測納米粒在交變磁場下細胞內(nèi)熱療及聯(lián)合放療后三種腫瘤細胞的凋亡；⑤流式細胞術PI單染法檢測納米粒在交

9、變磁場下腫瘤細胞的周期變化；⑥γH2AX焦點實驗檢測三種腫瘤細胞放療聯(lián)合納米粒交變磁場下熱療與單獨放療相比，其焦點數(shù)目隨時間的變化情況；⑦鼻咽癌低分化鱗狀細胞系CNE-2的裸鼠移植瘤瘤體內(nèi)注射納米粒，置于交變磁場下熱療，聯(lián)合放療分組，檢測瘤體增長，繪制瘤體生長曲線，檢測其對瘤體組織的放射增敏作用。
　　結果：①MTT結果顯示：H460細胞：放射治療組細胞存活率61.7±4％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞存活率42±5％；CNE-2細

10、胞：放射治療組細胞存活率60.1±1.9％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞存活率40.6±1.4％；HNE-1細胞：放射治療組細胞存活率56.2±2.6％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞存活率36.7±1.1％。②克隆形成實驗結果：H460細胞的納米粒細胞內(nèi)熱療SER=1.3847；CNE-2細胞的納米粒細胞內(nèi)熱療 SER=1.2755；HNE-1細胞的納米粒細胞內(nèi)熱療SER=1.4421。③Westerblot檢測結果顯示：三種腫瘤細胞的蛋白

11、表達量趨勢相同：對照組細胞HSP70表達較低，納米粒組與對照組表達相當，納米粒在交變磁場下作用后其表達量明顯增高（P<0.01）；與放療聯(lián)合作用后其表達量與放療組相比明顯增高（P<0.01）;caspase-3的表達具有同樣的趨勢。④流式細胞術凋亡檢測結果：H460細胞：放射治療組細胞凋亡率24.57±0.6545％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞凋亡率34.92±0.6983％；CNE-2細胞：放射治療組細胞凋亡率25.77±0.3332

12、％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞凋亡率60.53±0.8386％；HNE-1細胞：放射治療組細胞凋亡率18.09±0.1170％，聯(lián)合納米粒細胞內(nèi)熱療后細胞凋亡率48.35±0.3837％。⑤流式細胞儀周期檢測結果：H460細胞對照組G2細胞=5.22±0.028％，納米粒細胞內(nèi)熱療G2期=30.82±3.32％；CNE-2細胞對照組G2細胞=6.72±2.16％，納米粒細胞內(nèi)熱療G2期=24.24±1.47％；HNE-1細胞對照組G2細

13、胞=6.65±0.33％，納米粒細胞內(nèi)熱療G2期=37.19±1.25％。⑥γH2AX焦點檢測結果：三種腫瘤細胞的焦點數(shù)隨著時間延長均逐漸減少，在處理后2h內(nèi)，處理組與對照組細胞的焦點數(shù)并無明顯差異，而在處理4h后，細胞內(nèi)熱療聯(lián)合放療組的焦點數(shù)量明顯大于單獨放療組（P<0.01）。⑦成功建立了人鼻咽癌 CNE-2細胞裸鼠移植瘤模型，瘤體生長曲線可見納米粒細胞內(nèi)熱療組裸鼠的腫瘤體積隨時間延長其增長明顯減緩，對比對照組有明顯差異（P<0.0

14、1）；細胞內(nèi)熱療聯(lián)合放療組裸鼠的瘤體體積隨時間延長瘤體體積明顯減小，與放療組相比差異有顯著性（P<0.01）。
　　結論：①通過MTT腫瘤抑制實驗及克隆形成實驗證明了納米粒細胞內(nèi)熱療的放射增敏作用；②初步探明了納米粒細胞內(nèi)熱療放射增敏的機制：通過增加HSP70蛋白及 caspase-3蛋白的表達，增加了腫瘤細胞的凋亡；納米粒細胞內(nèi)熱療使腫瘤細胞阻滯在G2期，而G2期細胞對放射線敏感，且細胞內(nèi)熱療能延緩了放射線致腫瘤細胞DNA雙鏈斷