Fe3O4磁性納米顆粒的細(xì)胞效應(yīng)及發(fā)生機(jī)理研究.pdf

1、隨著納米生物技術(shù)的發(fā)展，氧化鐵磁性納米顆粒(MNP)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)具有了廣泛的應(yīng)用，如，核磁共振成像造影劑、腫瘤磁熱療、靶向藥物載體、生物分子的標(biāo)記、分離與純化等。為了評價MNP在生物體系應(yīng)用中的安全性并進(jìn)一步發(fā)展其在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用，目前已有大量的研究表征了不同理化性質(zhì)的MNP具有的生物效應(yīng)。然而，大部分研究使用一種細(xì)胞系進(jìn)行觀察研究，缺少來自不同物種或不同組織的細(xì)胞間系統(tǒng)的比較，也未就細(xì)胞生理表型變化在分子水平上的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行深入

2、研究。因此，使用多種細(xì)胞系和不同濃度及處理時間系統(tǒng)研究MNP作用細(xì)胞后引發(fā)的細(xì)胞效應(yīng)及其發(fā)生機(jī)理仍是納米生物技術(shù)研究領(lǐng)域的重要課題。
　　本研究采用多濃度(20～100μg/mL)、多時間點(diǎn)(2～72h)和多種細(xì)胞系，包括小鼠巨噬細(xì)胞（RAW264.7）、小鼠肝癌細(xì)胞(Hepa1-6)、人單核細(xì)胞(THP-1)、人肝癌細(xì)胞（HepG2）、人正常肝臟細(xì)胞(HL-7702)及人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)，檢測了熱解油酸-鐵制備的二巰基丁二

3、酸(DMSA)包被的Fe3O4 MNP的細(xì)胞效應(yīng)，并運(yùn)用基因芯片技術(shù)檢測這種MNP對細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，從分子水平上分析細(xì)胞效應(yīng)的分子機(jī)制。本論文取得的主要結(jié)果如下:
　　1.通過普魯士藍(lán)染色、溶酶體染色、透射電鏡(TEM)觀察及比色法鐵含量測定，研究了合成的DMSA-Fe3O4 MNP標(biāo)記細(xì)胞的效率。TEM及溶酶體染色觀察顯示DMSA-Fe3O4 MNP經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入細(xì)胞，主要分布于細(xì)胞溶酶體內(nèi)。普魯士藍(lán)染色和鐵含量定量分析表明，

4、所研究的6種哺乳動物細(xì)胞均能攝取這種DMSA-Fe3O4 MNP，但攝取效率在細(xì)胞系間存在差異。RAW264.7細(xì)胞攝取效率最高，而HepG2和HL-7702細(xì)胞吞噬能力較弱。此外，細(xì)胞對DMSA-Fe3O4 MNP的攝取具有時間和濃度雙重依賴性。低濃度長時間作用導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的鐵含量高于高濃度短時間作用，提示在研究DMSA-Fe3O4 MNP的細(xì)胞效應(yīng)時要考慮其長時期作用效果。
　　2.氧化鐵納米顆粒進(jìn)入細(xì)胞后，不可避免地與細(xì)胞內(nèi)組

5、分發(fā)生相互作用，從而對細(xì)胞的某些功能造成損傷。為了評價DMSA-Fe3O4 MNP的生物相容性，本研究系統(tǒng)地檢測了其對6種哺乳動物細(xì)胞系多種生理功能的影響。顯微觀察顯示DMSA-Fe3O4 MNP處理細(xì)胞后，細(xì)胞形貌、細(xì)胞骨架及膜系統(tǒng)并未受到嚴(yán)重破壞。在所研究的濃度范圍(20～100μg/mL)和作用時間段(2～72h)，細(xì)胞活力隨DMSA-Fe3O4 MNP的濃度升高而呈現(xiàn)輕微地下降，但僅有RAW264.7和HepG2細(xì)胞在高濃度長時

6、間處理下具有顯著性差異。氧化應(yīng)激測定表明，細(xì)胞內(nèi)總超氧化物歧化酶和黃嘌呤氧化酶水平并沒有顯著的變化，但丙二醛水平在多個濃度下顯著增高。各濃度的DMSA-Fe3O4 MNP對細(xì)胞周期未產(chǎn)生顯著影響。高濃度(100μg/mL)的DMSA-Fe3O4 MNP顯著地誘導(dǎo)THP-1和HepG2細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)果顯示，DMSA-Fe3O4 MNP具有較好的生物相容性，尤其在體內(nèi)常用劑量（30μg/mL）下對細(xì)胞多種生理功能并不產(chǎn)生顯著影響。

7、　　3.由于細(xì)胞的所有生理表型都基于特定基因的時空特異表達(dá)。因此，納米顆粒作用于細(xì)胞后引發(fā)細(xì)胞效應(yīng)（如活力下降、氧化應(yīng)激水平升高及誘導(dǎo)凋亡等），也必然受相應(yīng)基因調(diào)控。為了從基因水平上研究DMSA-Fe3O4 MNP對細(xì)胞的潛在影響，本研究使用Affymetrix公司的Mouse Genome 4302.0基因組表達(dá)譜芯片檢測了100μg/mL DMSA-Fe3O4 MNP對RAW264.7細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響。在DMSA-Fe3O4MN

8、P處理4、24和48h后，分別檢測到711、545和434個差異表達(dá)基因(differentially expressed gene，DEG)。這些DEG中，有27個基因在三個時間點(diǎn)持續(xù)上調(diào)，另有6個基因持續(xù)下調(diào)。所有DEG的生物信息學(xué)分析表明多個與炎癥、免疫反應(yīng)及病毒刺激相關(guān)的基因顯著上調(diào);參與氧化應(yīng)激及脂質(zhì)過氧化保護(hù)性應(yīng)答基因發(fā)生下調(diào);同時，與細(xì)胞周期、繁殖、生物大分子合成及能量代謝相關(guān)基因顯著下調(diào)。結(jié)果提示，DMSA-Fe3O4M

9、NP可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激、炎癥和免疫反應(yīng)，并抑制細(xì)胞的生物合成和代謝過程，這與細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　4.為了進(jìn)一步分析DMSA-Fe3O4 MNP對不同細(xì)胞系基因表達(dá)譜的影響，本研究比較了小鼠巨噬細(xì)胞和肝癌細(xì)胞在DMSA-Fe3O4 MNP處理前后的基因表達(dá)譜的變化?；蛐酒瑱z測出數(shù)千個基因表達(dá)發(fā)生變化，絕大多數(shù)DEG在DMSA-Fe3O4 MNP濃度和細(xì)胞系間有不同的表達(dá)模式。只有15個DEG在四種處理下表達(dá)持續(xù)改變，

10、如，Id3、Slc25a23、Tfrc、Klf4、Fxyd2、Lcn2、Illrn、Slpi及Serpinb9b等基因。這些基因反映了不同哺乳動物細(xì)胞對DMSA-Fe3O4MNP處理作出的共同應(yīng)答?；虮倔w論(Gene Ontology,GO)聚類分析表明，在RAW264.7細(xì)胞中，DEG主要參與內(nèi)吞作用、免疫反應(yīng)和鐵離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。而在Hepa1-6細(xì)胞中DEG涉及細(xì)胞發(fā)育、催化活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)。隨著細(xì)胞內(nèi)鐵含量的升高，DMSA-

11、Fe3O4 MNP對Hepa1-6細(xì)胞造成與RAW264.7細(xì)胞相似的炎癥、免疫應(yīng)答和趨化反應(yīng)等效應(yīng)。執(zhí)行這些功能的DEG在兩種細(xì)胞間不盡相同。兩種細(xì)胞間的DEG的差別表明DMSA-Fe3O4 MNP對不同細(xì)胞系具有不同的基因效應(yīng)，取決于細(xì)胞系所具有的生物學(xué)功能。
　　5.基因芯片檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)GO條目得到顯著富集，提示細(xì)胞內(nèi)吞的DMSA-Fe3O4 MNP，可能通過釋放鐵離子影響細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)。熒光定量PCR結(jié)果證實(shí)3個

12、與鐵穩(wěn)態(tài)相關(guān)的關(guān)鍵性基因，Tfrc、Trf和Lcn2表達(dá)發(fā)生變化，并在鐵離子螯合劑去鐵胺作用下Tfrc和Lcn2基因表達(dá)變化受到抑制。本研究設(shè)計了一種基于高速離心方法測定細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量和氧化鐵納米顆粒含量的方法。結(jié)果表明細(xì)胞內(nèi)總的鐵含量、氧化鐵納米顆粒含量及鐵離子含量均顯著增加。在體外模擬溶酶體酸性環(huán)境中，DMSA-Fe3O4 MNP發(fā)生降解，并導(dǎo)致溶液中鐵離子含量升高。這些結(jié)果證實(shí)細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量的升高是由聚集在溶酶體內(nèi)的DMSA-

13、Fe3O4 MNP發(fā)生降解而造成的。細(xì)胞鐵離子過載導(dǎo)致多個負(fù)責(zé)可溶性物質(zhì)載體家族成員的表達(dá)下調(diào)，如Slc5a3和Slc44a1，以阻止更多的有機(jī)溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞，從而降低細(xì)胞內(nèi)被鐵離子升高的滲透壓。這些結(jié)果解釋了DMSA-Fe3O4 MNP引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)及滲透壓穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化的分子機(jī)制。
　　6.為了進(jìn)一步探討DMSA-Fe3O4 MNP在活體內(nèi)的動態(tài)分布及主要臟器分布，為下一步的體內(nèi)基因表達(dá)譜的研究提供組織和細(xì)胞選取的依據(jù)，本研究利

14、用近紅外熒光素(IRDye800CW，ex/em=775/788nm)及活體成像技術(shù)研究了這種納米顆粒在機(jī)體內(nèi)的動態(tài)代謝過程及主要臟器分布。IRDye800CW標(biāo)記的Fe3O4MNP對RAW264.7細(xì)胞具有很好的標(biāo)記效率并對細(xì)胞活力沒有顯著影響，這樣與未標(biāo)記的Fe3O4 MNP相當(dāng)。將這種帶近紅外熒光素標(biāo)記的Fe3O4 MNP以2和5mg/kg體重的劑量經(jīng)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，使用近紅外熒光成像儀對小鼠進(jìn)行24h不連續(xù)成像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)