一種新的人突變SOD1轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立和臨床表型研究.pdf

1、背景:
　　肌萎縮側(cè)索硬化癥,也稱“盧伽雷氏病”或“漸凍人癥”,是以上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性為主要特征的一種神經(jīng)變性疾病。病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在ALS患者病灶中有不溶性蛋白質(zhì)的沉積,臨床可表現(xiàn)為進(jìn)行性的運(yùn)動(dòng)功能障礙、吞咽困難、骨骼肌萎縮等,常在發(fā)病后3~5年內(nèi)死亡。這種疾病廣泛發(fā)生于世界各地,按照有無家族性遺傳背景,可分為 FALS和 SALS。目前除力如太能稍延緩病情進(jìn)展外,尚無有效的治療方式。因此有必要對(duì)ALS進(jìn)行深入研究,揭示其發(fā)病

2、機(jī)制,為治療和預(yù)防提供理論基礎(chǔ)。
　　80~90％的ALS為SALS,另外10~20%的患者為具有家族性遺傳背景的FALS。FALS與 SALS均表現(xiàn)為同時(shí)存在上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)損害的體征,具有相似的肌電圖特征,病理學(xué)組織學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)上、下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害的依據(jù)。因此,FALS是很好的研究ALS發(fā)病機(jī)制研究的疾病模型。FALS患者中約20%是由Cu/Zn超氧化物歧化酶(Cu/Zn superoxide dismutase,SOD1)突變

3、引起的。在有氧生物體內(nèi),SOD1主要催化O2-+ O2+2H+→ H2O2+ O2,是催化超氧化陰離子歧化作用的主要酶類,。自1993年Rosen首次報(bào)道FALS發(fā)病與SOD1突變相關(guān)以來[1],目前已發(fā)現(xiàn)超過160種與ALS的發(fā)病相關(guān)的SOD1基因突變類型(http://alsod.iop.kcl.ac.uk/)。以突變SOD1為基礎(chǔ)建立起來的細(xì)胞和動(dòng)物模型被廣泛用于ALS的研究。
　　錯(cuò)義突變占到SOD1的突變類型的大多數(shù),即

4、表達(dá)蛋白中某個(gè)氨基酸被替換,其中93位的甘氨酸→丙氨酸(Gly→Ala,G93A)突變?yōu)槌Ｒ姷耐蛔冎?。有少?shù)為非錯(cuò)義突變,即突變導(dǎo)致翻譯提前終止,編碼蛋白分子的一段序列缺失。由于在病程、發(fā)病年齡、病情嚴(yán)重程度上不同的FALS患者,其SOD1基因突變類型也不同。因此,突變SOD1的基因型可能是決定患者臨床表型的主要因素。
　　最初的研究認(rèn)為,由于SOD1基因突變,SOD1功能喪失(loss-of-function),從而導(dǎo)致酶活性

5、下降,抗氧化作用減弱,活性氧濃度升高,從而引起神經(jīng)元損傷。臨床研究發(fā)現(xiàn),SOD1基因突變導(dǎo)致的ALS患者紅細(xì)胞內(nèi)SOD1活性較正常人下降約50~60%,而突變 SOD1基因攜帶者紅細(xì)胞內(nèi) SOD1活性也明顯降低。通過對(duì)敲除 SOD1基因小鼠的研究發(fā)現(xiàn),敲除SOD1基因后,小鼠沒有出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損害。說明突變SOD1的細(xì)胞毒性作用可能是由于功能獲得(gain-of-function),即突變的SOD1獲得的一些新功能,從而導(dǎo)致神經(jīng)元損害。

6、研究認(rèn)為突變SOD1構(gòu)象不穩(wěn)定,易發(fā)生去折疊,引起突變蛋白聚集物的形成,可以通過自身與其它蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)生理病理改變。
　　史樹貴教授的研究小組在重慶地區(qū)發(fā)現(xiàn)一個(gè)涉及4代,受累患者多達(dá)14人的ALS大家系,為常染色體顯性遺傳,其臨床表型特殊,與目前文獻(xiàn)報(bào)道不完全一致。對(duì)該家系成員基因組進(jìn)行聚合酶鏈-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(PCR-SSCP)、測(cè)序,發(fā)現(xiàn)部分家系成員的2號(hào)外顯子編碼區(qū)發(fā)生了堿基插入突變,導(dǎo)致閱讀框改變,轉(zhuǎn)

7、錄和翻譯時(shí)發(fā)生錯(cuò)誤,使2號(hào)外顯子的32個(gè)氨基酸殘基縮短為12個(gè),突變后的SOD1蛋白質(zhì)為由35個(gè)氨基酸組成的短肽。這是一種新的 SOD1基因突變類型(mSOD1, GeneBank:EF143990.1)。在前期實(shí)驗(yàn)中,我們已證實(shí)表達(dá)該突變SOD1后,神經(jīng)元的活性顯著下降,神經(jīng)元出現(xiàn)損傷的形態(tài)學(xué)改變。同時(shí),我們獲得了該突變SOD1基因(mutant SOD1, mSOD1)編碼的蛋白的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。我們準(zhǔn)備通過構(gòu)建mSOD1基因表達(dá)載

8、體,將其注入小鼠受精卵細(xì)胞,移植于假孕母鼠中,獲得表達(dá) mSOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠,為后續(xù)深入研究ALS的致病機(jī)制提供較好的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠臨床表型和功能檢測(cè),可以初步明確該SOD1突變類型在重慶市這一具有特殊臨床表型ALS家系發(fā)病中的作用。
　　目的:
　　通過原核顯微注射技術(shù),構(gòu)建一種新的表達(dá)人 mSOD1的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。通過運(yùn)動(dòng)功能檢測(cè)、病理學(xué)研究、蛋白組學(xué)研究、免疫組化等方法,觀察轉(zhuǎn)基因小鼠的臨床表型,從而初

9、步明確該mSOD1類型與ALS的發(fā)病關(guān)系。
　　方法:
　　構(gòu)建攜帶mSOD1基因的PCI質(zhì)粒載體,用受精卵原核顯微注射的方法制備轉(zhuǎn)基因小鼠。利用PCR方法鑒定出生的后代,通過懸尾實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)輪實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)試驗(yàn)、足跡分析等檢測(cè)小鼠運(yùn)動(dòng)功能,Western-Blot檢測(cè)小鼠脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元mSOD1蛋白表達(dá),免疫組化技術(shù)檢測(cè) mSOD1在轉(zhuǎn)基因鼠小鼠脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)的表達(dá),使用透射電子顯微鏡對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的脊髓及皮層運(yùn)動(dòng)神經(jīng)

10、元進(jìn)行超微病理研究。
　　結(jié)果:
　　PCR結(jié)果證實(shí)獲得了表達(dá)人 mSOD1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,其中首建鼠2只, F1代鼠2只,F2代鼠2只,F3代鼠1只。在出生后240d左右,mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能障礙。行為學(xué)檢測(cè)顯示,mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中雙下肢不能充分伸展,不能翻轉(zhuǎn)身體。mSOD1轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)輪上停留的時(shí)間為59.17±26.27sec,野生型小鼠為171.83±20.98sec,轉(zhuǎn)基因小鼠停留時(shí)間

11、明顯短于野生型小鼠(P<0.01)。足跡分析顯示轉(zhuǎn)基因小鼠在出生8月左右出現(xiàn)雙下肢跛行、拖曳,足跡欠規(guī)整,轉(zhuǎn)基因小鼠后肢足間距測(cè)量結(jié)果為34.83±9.72mm,野生型小鼠后肢足間距測(cè)量結(jié)果為52.78±7.22mm,轉(zhuǎn)基因小鼠后肢足間距明顯小于野生型小鼠(P<0.01)。Western-Blot結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓和皮層中均表達(dá)了 mSOD1蛋白,免疫組化結(jié)果顯示在脊髓和皮層神經(jīng)元胞漿中有 mSOD1表達(dá),透射電鏡觀察到其運(yùn)動(dòng)神經(jīng)