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文檔簡(jiǎn)介
1、低血磷性佝僂病(hypophosphatemic rickets,HR)是由于腎小管對(duì)磷的重吸收降低而造成的以骨骼礦化不良、骨軟化和佝僂病為主要特征的一組疾病,其主要臨床表現(xiàn)為血磷減少、尿磷增多、佝僂病和骨軟化癥等,在新生兒中的發(fā)病率約為兩萬(wàn)分之一。遺傳性低血磷性佝僂病具有明顯遺傳異質(zhì)性,根據(jù)遺傳方式可以分為以下幾種:1)X連鎖低血磷性佝僂病(X-linkedhypophosphatemic rickets,XLHR,MIM307800
2、),其致病基因是PHEX(phosphate regulating endopeptidase homolog,X-linked);2)常染色體顯性低血磷性佝僂病(autosomal dominant hypophosphatemic rickets,ADHR,MIM193100),其致病基因是FGF23(Fibroblast Growth Factor23);3)常染色體隱性低血磷性佝僂病(autosomal recessive hy
3、pophosphatemic rickets,ARHR,MIM241520和613312),其致病基因是DMP1(Dentin Matrix Protein1)或ENPP1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase1);4)伴有高尿鈣癥的遺傳性低血磷性佝僂病(hereditary hypophosphatemic rickets with hypercalciuria,HHRH,M
4、IM241530),其致病基因是SLC34A3(solute carrierfamily34,memher3)。
DMP1基因的編碼產(chǎn)物是一種酸性非膠原細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,屬于SIBLING(Small Integrin-Binding Ligand N-linked Glycoprotein)家族成員。該家族成員不僅具有相似的生物學(xué)特性,而且在染色體上成簇排列。DMP1基因在人類染色體上位于4q21-22,在小鼠染色體上位于
5、5q21。DMP1在骨骼和牙齒中表達(dá)較高,在多個(gè)非礦化的組織中也有表達(dá),但表達(dá)水平較低。DMP1蛋白在翻譯后被水解成兩個(gè)片段:N末端的37 kDa大小的片段和C末端的57 kDa大小的片段,然而目前并不清楚哪一個(gè)片段在骨骼和牙齒發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮更重要的作用。
Dmp1基因敲除小鼠在胚胎期和剛出生時(shí)沒(méi)有明顯的異常表型,提示Dmp1基因不是小鼠早期骨骼和牙齒發(fā)育所必需的。在出生后,Dmp1基因敲除小鼠表現(xiàn)出明顯的牙齒發(fā)育異常,具
6、體表現(xiàn)為前牙本質(zhì)向牙本質(zhì)成熟過(guò)程缺陷、牙髓腔和牙根管變大、前牙本質(zhì)變寬、牙本質(zhì)變窄并且礦化不全。Dmp1基因敲除小鼠還表現(xiàn)出第3磨牙的缺損或發(fā)育遲緩,以及牙周缺陷,包括牙槽骨疏松和牙骨質(zhì)缺陷等。Dmp1基因敲除小鼠在骨骼方面表現(xiàn)出礦化程度降低、骨軟化癥和佝僂病等癥狀,具體表現(xiàn)為椎骨和長(zhǎng)骨長(zhǎng)度變短、直徑變大、次級(jí)骨化中心發(fā)育遲緩和畸形、生長(zhǎng)板變寬并且不規(guī)則(由于增殖區(qū)細(xì)胞增殖活性升高和肥大軟骨細(xì)胞區(qū)細(xì)胞凋亡降低引起)和骨骺區(qū)變大(由于血管
7、侵入受損引起)。Dmp1基因敲除小鼠同時(shí)伴有腎磷代謝異常和Fgf23含量升高,但是尿鈣含量正常。
本課題組曾在一個(gè)ARHR家系的患者中檢測(cè)到DMP1基因第1484-1490位核苷酸純合缺失,這7個(gè)堿基的缺失引起移碼突變,使該蛋白C末端最后18個(gè)氨基酸殘基被33個(gè)新的氨基酸殘基取代,且被替代的18個(gè)氨基酸殘基在種屬間高度保守。本課題分析了該家系A(chǔ)RHR患者的牙齒表型,并分析了突變蛋白的體外功能。為進(jìn)一步研究該DMP1突變的分
8、子和病理生理學(xué)機(jī)制,我們制作了含有該突變的小鼠模型并對(duì)其進(jìn)行了表型分析。
第一,分析DMP1C末端缺失患者牙齒表型發(fā)現(xiàn),患者具有明顯的牙齒發(fā)育異常:對(duì)該家系患者的口腔X光片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),患者的乳牙和恒牙都表現(xiàn)出明顯的異常,包括牙髓腔和牙根管變大,牙本質(zhì)變薄,牙釉質(zhì)的缺損等。
第二,體外分析提示突變蛋白保留DMPI蛋白的部分功能。對(duì)比分析由DMP1基因突變導(dǎo)致的APHR患者和Dmp1基因敲除小鼠表型特點(diǎn)發(fā)現(xiàn),兩
9、者具有一些類似表型,如低血磷癥等;但也存在一些差異。這些差異可能是由于人和小鼠之間的種屬特異性造成的,也可能是由于突變的DMPI蛋白仍保留有部分功能。為明確C末端缺失突變對(duì)DMP1功能的影響及其致病機(jī)制,本課題首先在體外分析了該缺失突變對(duì)DMP1蛋白水解和分泌的影響,并分析了該突變對(duì)ERK磷酸化活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)DMP1蛋白的C末端突變不影響該蛋白的正常分泌和水解,C末端突變的DMP1蛋白仍保留有部分的激活ERK信號(hào)通路的功能,表明突
10、變蛋白沒(méi)有完全喪失功能。
第三,構(gòu)建了具有與ARHR患者相同突變的Dmp1突變小鼠模型:為分析DMP1C末端突變的致病機(jī)制,我們首先采用轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)建了一種轉(zhuǎn)基因小鼠,該轉(zhuǎn)基因小鼠在3.6 kb Colla1啟動(dòng)子的啟動(dòng)下表達(dá)含有與ARHR患者相同突變的全長(zhǎng)Dmp1基因。我們成功得到了11只founder小鼠,并選取了其中3個(gè)獨(dú)立的品系,用RT-PCR和原位雜交的方法對(duì)其進(jìn)行了表達(dá)分析,轉(zhuǎn)基因在骨骼和牙齒中的表達(dá)模式與內(nèi)源
11、性的Dmp1基因基本一致,表達(dá)量高于內(nèi)源性的Dmp1基因。X光片結(jié)果顯示,與對(duì)照小鼠相比,表達(dá)突變型Dmp1基因的轉(zhuǎn)基因小鼠沒(méi)有明顯的骨骼和牙齒表型。在此基礎(chǔ)上,我們將該轉(zhuǎn)基因小鼠與Dmp1基因敲除小鼠雜交,獲得了僅表達(dá)外源性突變型Dmp1基因而不表達(dá)內(nèi)源性野生型Dmp1基因的小鼠,即Dmp1基因突變小鼠模型。
第四,Drop1基因突變小鼠模型從骨骼、牙齒和生化指標(biāo)等多方面再現(xiàn)了人類突變患者的表型特征:我們利用組織學(xué)、X光
12、片、Micro-CT、掃描電子顯微鏡、雙熒光標(biāo)記和血清生化分析等技術(shù)系統(tǒng)全面地分析了Dmp1基因突變小鼠的表型,并與RHR患者的癥狀和Dmp1基因敲除小鼠的表型進(jìn)行比較。
1)骨骼表型:小鼠全身X光片和后肢X光片顯示,Dmp1基因突變小鼠表現(xiàn)出佝僂病表型,包括股骨和脛骨長(zhǎng)度變短,干垢端變大、生長(zhǎng)板變寬和骨骼形態(tài)改變。定量分析結(jié)果顯示,Dmp1基因突變小鼠的脛骨長(zhǎng)度與正常對(duì)照相比變短,但是變短程度不如Dmp1基因敲除小鼠明顯
13、。骨骼石蠟切片的Safranin-O染色也進(jìn)一步驗(yàn)證了佝僂病特征,生長(zhǎng)板明顯變寬,其中肥大軟骨細(xì)胞層的變寬程度最大,靜止層和增殖層也有一定程度的變寬。Goldner染色結(jié)果顯示Dmp1基因突變小鼠骨皮質(zhì)中含有非常多的類骨質(zhì),表現(xiàn)出骨骼礦化不全和骨軟化癥。雙熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示骨骼礦化速率降低、礦化過(guò)程紊亂。掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示Dmp1基因突變小鼠的骨細(xì)胞lacuna-canalicular系統(tǒng)異常,骨細(xì)胞體積變大,表面粗糙,突觸變短并且變
14、少。這些異常的骨骼表型嚴(yán)重程度明顯低于Dmp1基因敲除小鼠,但是與ARHR患者骨骼異常一致,表明Dmp1基因突變小鼠模型較好地模擬了人類突變的骨骼方面表型。
2)牙齒表型:小鼠牙齒的X光片和Micro-CT分析結(jié)果顯示,Dmp1基因突變小鼠牙本質(zhì)變薄,牙髓腔和牙根管體積變大,但是表型程度比Dmp1基因敲除小鼠要輕。牙齒切片的H&E染色結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了X光片和Micro-CT的分析結(jié)果,Dmp1基因突變小鼠的前牙本質(zhì)變寬,
15、而牙本質(zhì)變窄。雙熒光標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示Dmp1基因突變小鼠牙本質(zhì)礦化形成的速度明顯變慢、牙本質(zhì)礦化過(guò)程出現(xiàn)異常。此外,Dmpl基因突變小鼠還表現(xiàn)出下頜骨節(jié)發(fā)育異常。然而以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及反向散射掃描電子顯微鏡結(jié)果都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Dmp1基因突變小鼠中有任何的牙釉質(zhì)缺陷,這一結(jié)果與ARHR患者的牙釉質(zhì)缺陷癥狀不同。這些結(jié)果提示Dmp1基因突變小鼠模型較好地模擬了人類突變的牙本質(zhì)方面表型,而ARHR患者中發(fā)現(xiàn)的牙釉質(zhì)缺陷可能是由于DMP1基因突變之外的其
16、他因?yàn)閷?dǎo)致。
3)血清生化指標(biāo)分析:Dmp1基因突變小鼠血清中Fgf23分子含量升高,磷的含量降低,但是改變程度較??;血清中鈣的含量沒(méi)有明顯變化。這一結(jié)果與ARHR患者非常一致,但改變程度比Dmp1基因敲除小鼠的改變程度小很多。
綜上所述,Dmp1基因突變小鼠在以上三方面再現(xiàn)了人類突變表型特征,但是與Dmp1基因敲除小鼠相比,該突變所引起的表型效應(yīng)較輕,也提示該突變蛋白仍保留了部分功能。
Dmp
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