MiR-142-5p高表達及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析.pdf

1、第一部分 MiR-142-5p高表達或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立
　　目的:
　　建立miR-142-5p在骨組織內(nèi)特異性高表達及抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以進一步分析miR-142-5p在小鼠體內(nèi)對骨折愈合的影響。
　　方法:
　　(1)、首先合成pre-miR-142和miR-142-5p sponge序列，序列兩端包含SalⅠ和EcoRⅠ酶切位點，插入到本實驗室保存的含骨鈣素啟動子的表達質(zhì)粒(pOG2-Cre-h

2、GH)中，替換原質(zhì)粒的Cre序列。構(gòu)建好的質(zhì)粒分別命名為Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S，經(jīng)測序及酶切后電泳驗證;(2)在MC3T3-E1前成骨細胞株中分別轉(zhuǎn)染Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S質(zhì)粒，使用含抗壞血酸及β-甘油磷酸鈉的培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨分化72h，使用PCR法檢測細胞內(nèi)miR-142-5p表達水平變化;(3)將Bglap-pre-miR-142和Bglap-mi

3、R-142-S表達質(zhì)粒通過顯微注射的方法注射到C57BL/6小鼠的受精卵原核內(nèi)，待小鼠出生后3周使用PCR法鑒定表達質(zhì)粒已整合到小鼠基因組中;(4)使用PCR法檢測miR-142-5p和miR-142-5psponge轉(zhuǎn)基因小鼠不同組織內(nèi)的miR-142-5p表達，驗證兩種小鼠是否存在骨組織特異性的miR-142-5p表達增加或降低。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建了含骨鈣素啟動子的pre-miR-142-5p和miR-142

4、-5psponge表達質(zhì)粒，其能在MC3T3-E1細胞向成骨細胞分化過程中表達，并導(dǎo)致細胞內(nèi)miR-142-5p增加或降低;
　　2、成功構(gòu)建了骨組織特異性表達的pre-miR-142-5p和miR-142-5p sponge轉(zhuǎn)基因小鼠，可導(dǎo)致骨組織特異性miR-142-5p表達增加或降低。
　　結(jié)論:
　　成功構(gòu)建了骨組織特異性miR-142-5p高表達或抑制的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為下一步體內(nèi)研究miR-142-5p在骨

5、折愈合過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分 MiR-142-5p高表達或抑制轉(zhuǎn)基因小鼠模型的骨折表型分析
　　目的:
　　研究體內(nèi)骨組織特異性miR-142-5p高表達或抑制對骨折愈合的影響，探討miR-142-5p在骨折愈合中的作用機制。
　　方法:
　　(1)、使用單側(cè)開放性股骨干橫形骨切開術(shù)并鎖釘內(nèi)固定法，在野生型、miR-142-5p骨組織特異性高表達型以及miR-142-5p骨組織特異性抑制型轉(zhuǎn)

6、基因小鼠中構(gòu)建骨折模型;(2)、使用X線攝片、組織切片HE染色檢測轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后7d、14d、21d的骨折愈合情況，觀察miR-142-5p高表達或抑制對骨折愈合的影響;(3)、使用qRT-PCR法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達水平，觀察其表達模式;(4)、使用qRT-PCR及Western Blot法檢測轉(zhuǎn)基因小鼠骨折部位WWP1的表達，在體內(nèi)驗證WWP1為miR-142-5

7、p的靶基因。
　　結(jié)果:
　　1、成功在野生型、miR-142-5p骨組織特異性高表達型及抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠中構(gòu)建骨折模型。
　　2、X線攝片顯示，在miR-142-5p骨組織特異性高表達小鼠，骨折愈合速度較WT型明顯加快，而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，骨折愈合速度較WT則明顯下降。
　　3、組織HE染色顯示，在miR-142-5p骨組織特異性高表達小鼠，骨痂的鈣化、編織骨的形成及塑形完成較WT明顯

8、增快，而在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，骨痂的鈣化、編織骨的形成較WT則明顯下降。
　　4、在WT小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平在骨折后21天達到高峰;而在miR-142-5p骨組織特異性高表達小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平表達增加且在骨折后14天即達到高峰;在miR-142-5p骨組織特異性抑制小鼠，miR-142-5p及骨鈣素水平較野生型顯著下降。
　　5、在小鼠中，骨折部位WWP1 mRNA

9、的表達水平隨著骨折后時間延長均呈顯著上升趨勢，并在骨折后21天達到高峰，在miR-142-5p抑制型轉(zhuǎn)基因小鼠上升較WT小鼠更顯著。
　　結(jié)論:
　　miR-142-5p骨組織特異性高表達可以促進骨折愈合，而miR-142-5p骨組織特異性抑制則延緩骨折愈合，miR-142-5p在動物模型骨折愈合過程中仍然通過靶基因WWP1發(fā)揮作用。
　　第三部分MiR-142-5p對衰老小鼠骨折愈合的治療作用
　　目的:

10、>　　建立衰老小鼠骨折模型，觀察agomir-142-5p對衰老小鼠骨折愈合的治療作用。
　　方法:
　　(1)、在18月齡的C57BL/6小鼠中行單側(cè)股骨骨干橫形骨切開術(shù)并鎖釘內(nèi)固定，構(gòu)建衰老小鼠骨折模型;(2)、使用qRT-PCR法檢測衰老小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨鈣素表達，觀察其表達模式;(3)、在骨折部位注射miR-142-5p擬似物agomir-142-5p，觀察衰老小鼠

11、骨折后28d的X線表現(xiàn);(4)、用組織HE染色法，觀察agomir-142-5p干預(yù)后衰老小鼠骨折后28d的骨折愈合情況。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建衰老小鼠骨折模型，并發(fā)現(xiàn)與年輕小鼠相比，衰老小鼠骨折后各個時期骨折部位miR-142-5p的表達均顯著降低。此外，衰老小鼠骨折后miR-142-5p的表達高峰延遲到骨折后28d。
　　2、在衰老小鼠，骨折后各個時期骨折部位骨鈣素的表達水平較年輕小鼠均顯著降低。
　

12、　3、骨折后28天，注射PBS或Agomir對照的衰老小鼠X線攝片仍可見模糊骨折線，骨痂量少，而在Agomir-142-5p注射的衰老小鼠，可見骨折線消失，骨痂較大，密度高。
　　4、在agomir-142-5p注射小鼠，28天時可見骨痂鈣化，部分連接成片，編織骨形成。而在agomir control及PBS注射小鼠，骨折后28天僅可見較多纖維性骨痂及軟骨性骨痂，部分鈣化。
　　結(jié)論:
　　Agomir-142-5p骨