小鼠骨折愈合中mmu-miR-142-5p表達(dá)激活支持成骨細(xì)胞功能的研究.pdf

1、第一章小鼠骨折愈合中骨痂組織mmu-miR-142-5p表達(dá)模式的研究
　　目的:
　　建立小鼠骨折愈合模型，研究mmu-miR-142-5p在小鼠骨折愈合過程的表達(dá)模式。
　　方法:
　　予C57BL/610-11周齡、雄性小鼠行單側(cè)開放性股骨干橫形骨切開并鎖釘內(nèi)固定術(shù)，建立小鼠骨折愈合模型;設(shè)立模型構(gòu)建后第7d、14d、21d、28d四個觀測點(diǎn)，放射學(xué)X線分析骨折部位;制作骨痂組織石蠟切片，HE染色，分析骨折

2、部位組織學(xué)變化;分離未經(jīng)造模的小鼠股骨干處骨組織（基線對照）及骨痂組織，Trizol提取組織總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測mmu-miR-142-5p及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物骨鈣素mRNA在對照骨組織及骨痂組織中的表達(dá)水平。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠單側(cè)開放性股骨干橫形骨切開術(shù)并鎖釘內(nèi)固定模型構(gòu)建成功，適用于小鼠骨折愈合的研究。
　　2.該模型小鼠新骨形成主要經(jīng)由軟骨內(nèi)成骨的方式;骨折愈合歷時(shí)28天基本完成，在建模后2

3、1天，骨性骨痂基本形成，成骨作用達(dá)高峰。
　　3.小鼠骨折愈合中骨痂組織的骨鈣素mRNA表達(dá)水平逐漸升高，至21天達(dá)到峰值（基線值4.15倍），后略有降低;其指向的成骨細(xì)胞功能狀態(tài)與放射學(xué)及組織學(xué)分析相符。
　　4.小鼠骨折愈合中骨痂組織的mmu-miR-142-5p表達(dá)水平逐漸升高，至21天達(dá)到峰值（基線值12.58倍），后略有降低;與骨鈣素mRNA的表達(dá)模式趨同。
　　結(jié)論:
　　小鼠骨折愈合中骨痂組織mmu

4、-miR-142-5p表達(dá)激活，或與成骨細(xì)胞活性相關(guān)。
　　第二章mmu-miR-142-5p對成骨細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究
　　目的:
　　研究mmu-miR-142-5p對成骨細(xì)胞礦化的影響，預(yù)測mmu-miR-142-5p的作用靶基因，初步探討mmu-miR-142-5p在成骨細(xì)胞礦化過程中的作用機(jī)制。
　　方法:
　　用β-甘油磷酸鈉和抗壞血酸誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞MC3T3-E1礦化，在礦化誘導(dǎo)第5、

5、11、17天分別采用agomiR-142-5p、agomiR-NC以及antagomiR-142-5p、 antagomiR-NC直接、連續(xù)轉(zhuǎn)染，同時(shí)設(shè)立空白對照(Mock)，以構(gòu)建mmu-miR-142-5p功能獲得性及功能缺失性的MC3T3-E1細(xì)胞模型;首次轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取各組細(xì)胞總RNA，實(shí)時(shí)定量RT-PCR測定mmu-miR-142-5p及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志物堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣

6、素(Osteocalcin，OC)mRNA的表達(dá)水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunosorbentassay，ELISA)檢測48小時(shí)后MC3T3-E1細(xì)胞分泌至培養(yǎng)液上清中ALP及OC的蛋白水平;礦化誘導(dǎo)21天即末次轉(zhuǎn)染后第4天，茜素紅染色及定量觀察各組基質(zhì)礦化情況;用TargetScan等靶基因預(yù)測軟件分析mmu-miR-142-5p在成骨礦化過程中的作用靶基因，在上述細(xì)胞模型首次轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取各組細(xì)

7、胞總RNA及總蛋白，實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Western雜交檢測靶基因mRNA和蛋白水平。
　　結(jié)果:
　　1.外源性核酸agomiR-142-5或antagomiR-142-5p轉(zhuǎn)染可上調(diào)或下調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中mmu-miR-142-5p的豐度及活性。
　　2.與對照組相比，agomiR-142-5p轉(zhuǎn)染能上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞ALP和OC mRNA及分泌的蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成，提高礦化結(jié)節(jié)茜素紅定

8、量;而antagomiR-142-5p轉(zhuǎn)染導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞ALP和OC mRNA及分泌的蛋白表達(dá)水平下降，礦化結(jié)節(jié)形成受阻，降低礦化結(jié)節(jié)茜素紅定量。
　　3.預(yù)測WWP1為成骨細(xì)胞礦化過程中mmu-miR-142-5p的作用靶基因。
　　4.與對照組相比，agomiR-142-5p轉(zhuǎn)染導(dǎo)致MC3T3-E1細(xì)胞WWP1蛋白水平下降，antagomiR-142-5p轉(zhuǎn)染可上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞WWP1蛋白水平，但二者對