肌腱干細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞衍生因子復(fù)合蠶絲-膠原支架促進(jìn)肌腱再生的研究.pdf

1、背景:
　　 隨著我國(guó)國(guó)民素質(zhì)的提高以及人們對(duì)健康體魄的向往,國(guó)人參加體育鍛煉和競(jìng)賽活動(dòng)的數(shù)量明顯增加,運(yùn)動(dòng)損傷也越來(lái)越多,其中韌帶肌腱損傷占50％以上。當(dāng)前,自體移植、同種異體移植、異種移植和假體材料修復(fù)術(shù)經(jīng)常用于修復(fù)韌帶和肌腱損傷。然而,這些手術(shù)重建再生技術(shù)有不同的弊端,例如供體部位并發(fā)癥、疾病傳播、免疫排斥和較差的支架整合性。
　　 近10年,隨著組織工程的興起,臨床醫(yī)學(xué)正步入一個(gè)“再生醫(yī)學(xué)”的新階段。在組織的修復(fù)

2、過(guò)程中,種子細(xì)胞占據(jù)了很重要的成分。常用種子細(xì)胞包括肌腱韌帶中的成纖維細(xì)胞,皮膚來(lái)源的成纖維細(xì)胞,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),胚胎干細(xì)胞(ESCs)和誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(IPSs)等。這些細(xì)胞有自己的優(yōu)勢(shì),同時(shí)也存在著一定的弊端,如細(xì)胞外基質(zhì)排列還顯紊亂,修復(fù)部位的骨化,一定的畸胎瘤發(fā)生率.最近,研究者們從肌腱組織中分離出了一種新型的干細(xì)胞,稱之為肌腱干／祖細(xì)胞(TSPCs)。這些細(xì)胞不僅有像MSC一樣的干細(xì)胞特性,而且高表達(dá)肌腱相關(guān)

3、的基因和蛋白質(zhì)。這些結(jié)果提示肌腱來(lái)源的肌腱干細(xì)胞(TSPCs)有修復(fù)損傷肌腱的潛能。除了外源性的種子細(xì)胞,機(jī)體內(nèi)部(內(nèi)源性)的細(xì)胞動(dòng)員也是促進(jìn)損傷組織修復(fù)的一個(gè)重要方面。
　　 在肌腱的生長(zhǎng)、發(fā)育、損傷和修復(fù)過(guò)程中,有很多的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子參與了活動(dòng)。如血小板相關(guān)生長(zhǎng)因子BB(PDGF-BB)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF-β)家族等。在我們之前的細(xì)胞治療研究中,我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)

4、因子-beta3(TGF-beta3),生長(zhǎng)分化因子5(GDF5),骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(BMP2),bFGF和間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)等在損傷部位含量升高。Minami和他的同事們的一項(xiàng)最近研究闡明了SDF-1的局部表達(dá)增加可以促進(jìn)BMSCs在系統(tǒng)注入后在損傷位點(diǎn)的遷移。我們認(rèn)為局部釋放的SDF-1可以調(diào)節(jié)損傷韌帶和肌腱的修復(fù)。
　　 鑒于肌腱組織需要承受強(qiáng)大的力學(xué),在損傷肌腱的組織工程中,我們需要通過(guò)支架材料復(fù)合干細(xì)胞或是

5、生長(zhǎng)因子／細(xì)胞因子等手段來(lái)促進(jìn)身體已損傷組織的再生。在我們之前的研究工作中,我們把蠶絲和膠原海綿復(fù)合在一起,構(gòu)建出了一個(gè)實(shí)用的肌腱組織工程支架。然而修復(fù)肌腱的結(jié)構(gòu)和功能與正常肌腱相比較,還是相差甚遠(yuǎn)。一種理想的,能吸引目的細(xì)胞在損傷部位集聚的有生物活性的蠶絲支架的組合仍然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。
　　 在此研究中,我們將蠶絲-膠原支架作為TSPCs和SDF-1體內(nèi)移植的載體,通過(guò)兩者的復(fù)合,來(lái)研究復(fù)合蠶絲-膠原支架能否進(jìn)一步促進(jìn)損傷肌

6、腱的修復(fù)。我們的研究將為損傷肌腱的修復(fù)帶來(lái)一種新的方式。
　　 我們的研究分為三部分:(1)種子細(xì)胞(TSPCs)的分離和鑒定(2)TSPCs復(fù)合蠶絲-膠原支架構(gòu)建組織工程肌腱,評(píng)估TSPCs對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用；(3)間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)復(fù)合蠶絲-膠原支架構(gòu)建組織工程支架用于損傷肌腱的修復(fù),評(píng)估SDF-1趨化的內(nèi)源性細(xì)胞對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用:
　　 第一章種子細(xì)胞(TSPCs)的分離和鑒定
　　

7、 目的:肌腱干細(xì)胞是近幾年發(fā)現(xiàn)的,來(lái)源于肌腱組織的干細(xì)胞。本部分的目的是研究肌腱干細(xì)胞的分離及三系分化能力的鑒定。
　　 方法與結(jié)果:體外試驗(yàn)中,我們?cè)u(píng)估了肌腱干細(xì)胞的克隆形成能力和三系分化能力。結(jié)果顯示肌腱干細(xì)胞顯示了干細(xì)胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力強(qiáng)和多系分化能力等。
　　 結(jié)論:來(lái)源于肌腱組織的肌腱干細(xì)胞(TSPCs)具有干細(xì)胞的一般特性,可能是體內(nèi)肌腱修復(fù)的理想外源性種子細(xì)胞來(lái)源。
　　 第二

8、章肌腱干細(xì)胞復(fù)合蠶絲.膠原支架促進(jìn)肩袖韌帶修復(fù)
　　 目的:研究肌腱干細(xì)胞復(fù)合蠶絲.膠原支架能否促進(jìn)肩袖韌帶的修復(fù)。
　　 方法與結(jié)果:體外試驗(yàn)中,我們?cè)u(píng)估了肌腱干細(xì)胞在材料表明的生長(zhǎng),增殖,肌腱相關(guān)基因表達(dá)情況。在體內(nèi)試驗(yàn)中,我們選擇兔子肩袖損傷作為動(dòng)物模型,將肌腱干細(xì)胞種植于蠶絲-膠原支架上后移植入兔子體內(nèi)評(píng)估其修復(fù)效果。結(jié)果顯示肌腱干細(xì)胞顯示了干細(xì)胞的一般特性,如克隆形成能力,增殖能力強(qiáng)和多系分化能力等。體外種植的

9、肌腱干細(xì)胞在蠶絲-膠原支架上增殖良好,無(wú)細(xì)胞毒性。體內(nèi)細(xì)胞移植結(jié)果顯示移植的細(xì)胞-支架沒(méi)有引發(fā)免疫反應(yīng),相反,在術(shù)后4周和8周的時(shí)間點(diǎn),其促進(jìn)了更多成纖維樣細(xì)胞的長(zhǎng)入,減少了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。術(shù)后12周,肌腱干細(xì)胞處理的實(shí)驗(yàn)組比單純支架的對(duì)照組表現(xiàn)為更多膠原組織的沉積,更好的膠原結(jié)構(gòu)和力學(xué)特性。
　　 結(jié)論:移植的肌腱干細(xì)胞通過(guò)分化為肌腱細(xì)胞和釋放抗炎癥因子抑制炎癥反應(yīng)等來(lái)促進(jìn)損傷肩袖組織的修復(fù)。因此,肌腱干細(xì)胞復(fù)合的蠶絲-膠原支

10、架是具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值的肌腱組織工程支架。
　　 第三章外源性間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)復(fù)合蠶絲-膠原支架協(xié)同增強(qiáng)損傷肌腱的再生
　　 目的:本研究目的是通過(guò)復(fù)合外源性的間質(zhì)細(xì)胞衍生因子來(lái)構(gòu)建一種具有生物活性的、能選擇性促進(jìn)內(nèi)源性細(xì)胞遷移的蠶絲-膠原支架用于損傷肌腱的修復(fù)。
　　 方法與結(jié)果:在體外,我們?cè)u(píng)估了外源性間質(zhì)細(xì)胞衍生因子(SDF-1)對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)、皮下成纖維細(xì)胞(HD

11、Fs)和跟腱細(xì)胞(ATFs)的轉(zhuǎn)移和相關(guān)基因表達(dá)的影響,構(gòu)建的支架促進(jìn)肌腱再生的效率在大鼠體內(nèi)跟骨腱(AT)損傷模型中測(cè)定。體外結(jié)果顯示BMSCs和HDFs的CXCR4基因表達(dá)和細(xì)胞遷移對(duì)外源性SDF-1敏感,而HDFs和ATFs的肌腱相關(guān)基因表達(dá)對(duì)外源性SDF-1更敏感。在大鼠AT損傷模型中,術(shù)后4天和1周外源性SDF-1在損傷部位可以減少炎癥細(xì)胞的浸入、加強(qiáng)成纖維狀的細(xì)胞轉(zhuǎn)移。4周后,SDF-1處理的實(shí)驗(yàn)組較單純材料的對(duì)照組表現(xiàn)為內(nèi)