炎癥因子和肌腱干細胞在肌腱病中的作用及干預研究.pdf

1、肌腱病是一種常見的軟組織疾病，多發(fā)于運動員及老齡化人群。肌腱鈣化及退化導致的疼痛，運動障礙及繼發(fā)性骨關節(jié)炎等造成了巨大的經(jīng)濟和社會負擔。但由于對肌腱病的發(fā)病機制了解有限，目前仍然缺少有效的肌腱病治療手段。因此，對肌腱鈣化及再生的細胞及分子機制的深入研究具有重要的理論意義和應用價值。
　　炎癥對于組織損傷后的修復與再生至關重要。但是，慢性炎癥導致組織器官內(nèi)部穩(wěn)態(tài)的破壞，參與了腫瘤、纖維化疾病、風濕性關節(jié)炎及脊柱關節(jié)炎等多種疾病的發(fā)展

2、過程。肌腱病中多種炎癥細胞及炎癥因子發(fā)生了改變。但是傳統(tǒng)的抗炎類藥物，如非甾體類抗炎藥(NSAIDs)和糖皮質(zhì)激素，僅僅具有鎮(zhèn)痛效果，而對于肌腱的功能恢復卻沒有顯著的促進作用。肌腱內(nèi)源性干/祖細胞具有自我更新及多向分化潛能，參與了肌腱組織穩(wěn)態(tài)、修復及疾病的發(fā)生。肌腱損傷后，肌腱干/祖細胞表型改變、向軟骨分化能力增強而向肌腱系分化減弱是導致肌腱修復不良及異位骨化的主要因素之一，是促進肌腱修復的潛在細胞靶點。但是，成體肌腱干/祖細胞在損傷后

3、的炎癥微環(huán)境中的再生功能如何改變及其調(diào)控的分子機制仍然有待明確。
　　近年來研究顯示，急性的、可控的炎癥反應不僅清除致病因素，同時調(diào)控組織內(nèi)部干/祖細胞的增殖和分化以及血管形成，促進受損組織的再生。由于炎癥反應所包涵的細胞和炎癥因子種類繁多且功能各異，為了實現(xiàn)有效的組織再生，需要高度特異性地抑制炎癥反應的負面作用，同時允許炎癥反應發(fā)揮應有的正向的調(diào)控作用。因此，對不同時期免疫反應的性質(zhì)和強度進行區(qū)分并進行其對肌腱干/祖細胞調(diào)控功能

4、的研究，有助于進一步明確肌腱修復及鈣化過程中的免疫調(diào)控機制，開發(fā)新的有效的肌腱病治療手段。
　　本研究的目的在于:(1)研究肌腱損傷及病理發(fā)展的不同時期，各種炎癥因子表達水平的變化，通過其變化趨勢分析不同時期參與肌腱修復調(diào)控的主要炎癥因子;(2)研究炎癥因子對于肌腱干細胞(Tendon Stem/Progenitor Cells，TSPCs)功能的調(diào)控作用，明確促進肌腱再生和抑制肌腱修復的主要炎癥因子;(3)在分子水平探索該炎癥因

5、子調(diào)控TSPCs分化的作用機制;(4)設計體內(nèi)外實驗，進一步運用小分子調(diào)控內(nèi)源TSPCs功能抑制肌腱鈣化、促進肌腱修復。
　　我們的研究結(jié)果分為以下四個部分:
　　一、炎癥因子在肌腱病不同時期的表達譜分析
　　為明確炎癥因子在肌腱病不同時期的表達變化，我們通過肌腱內(nèi)部注射Ⅰ型膠原酶建立大鼠肌腱病模型，在肌腱病發(fā)展的不同階段分別提取肌腱組織內(nèi)部的蛋白，進行炎癥因子表達譜分析。通過分析，我們發(fā)現(xiàn)肌腱損傷后1周內(nèi)，組織內(nèi)有大

6、量炎癥細胞浸潤，同時促炎癥因子白介素-1beta(IL-1β)水平顯著升高;損傷后2周，抗炎癥因子白介素-4（IL-4）和白介素-10(IL-10)水平上調(diào)，同時伴隨炎癥細胞數(shù)量減少，提示其免疫反應類型具有時期特異性。進一步分析損傷8周的慢性肌腱病組織，我們發(fā)現(xiàn)肌腱內(nèi)部炎癥細胞浸潤進一步減少，但是鈣化點周圍促炎癥信號通路NF-κB上調(diào)。另外，臨床人體芯片結(jié)果顯示慢性肌腱病組織與正常肌腱組織相比，促炎癥因子白介素-1 al pha(IL-

7、1α)及IL-1β有較低程度的上調(diào)，而抑炎癥因子IL-4和IL-10表達下調(diào)，提示慢性肌腱病中炎癥因子平衡失調(diào)。
　　以上結(jié)果顯示，肌腱損傷后促炎癥因子與抑炎癥因子依次上調(diào)，參與了炎癥的激活和消退;而慢性肌腱病中促炎癥因子和抑炎癥因子的平衡失調(diào)，可能參與了疾病的發(fā)展。
　　二、炎癥因子對于肌腱修復及鈣化的調(diào)控作用研究
　　為了探討體內(nèi)急性炎癥因子水平改變對于肌腱組織及鈣化的調(diào)控作用，我們分別用IL-1β(5ng/ml)

8、，IL-4(10ng/ml，20ng/ml)、M1和M2巨噬細胞的條件培養(yǎng)基短期（3天）處理體外培養(yǎng)的肌腱組織。結(jié)果顯示IL-4（20ng/ml）、M1和M2巨噬細胞的條件培養(yǎng)基可以維持和誘導肌腱特異的轉(zhuǎn)錄因子Scleraxis(Scx)的表達，而IL-1β(5ng/ml)會抑制Scx的表達。用IL-1β(5ng/ml)處理1周后，Scx表達持續(xù)降低，而TSPCs的增殖能力及軟骨系轉(zhuǎn)錄因子Sox9表達上調(diào);在含IL-1β誘導肌腱分化培養(yǎng)

9、基中，TSPCs的腱系分化降低;在骨誘導培養(yǎng)條件下，堿性磷酸酶(ALP)染色增強。為了進一步明確IL-1β對于肌腱干細胞(TSPCs)的調(diào)控作用，我們對三維培養(yǎng)的TSPCs分別進行IL-1β(5ng/ml)5天和8天的處理后去除IL-1β并繼續(xù)培養(yǎng)5天，結(jié)果顯示短期IL-1β處理對于TSPCs中Scx表達的抑制作用為可逆性的，而IL-1β長期處理后Scx表達不可恢復。
　　綜上所述，促炎癥因子IL-1β促進TSPCs增殖且可逆性降

10、低Scx表達，后期M2分泌的細胞因子，如抗炎癥因子IL-4可誘導TSPCs的Scx表達，有助于肌腱修復再生;而慢性炎癥中，促炎癥因子IL-1β導致TSPCs的Scx表達長期下調(diào)，抑制修復性的TSPCs向肌腱系分化，促進病理性的TSPCs向骨系分化，參與了鈣化性肌腱病的發(fā)展。
　　三、HIF-2α介導促炎癥因子IL-1β調(diào)控TSPCs分化的機制研究
　　為了進一步明確IL-1β調(diào)控TSPCs分化的分子機制，我們對于肌腱病表達芯

11、片進行分析，發(fā)現(xiàn)低氧誘導因子-2alpha（HIF-2α）顯著上調(diào)。通過免疫染色，免疫印跡，實時熒光定量PCR檢測顯示HIF-2α在正常肌腱中低表達，而在肌腱病樣本中顯著上調(diào)，且HIF-2α可被IL-1β(5ng/ml)誘導。過表達HIF-2α可抑制腱系基因的表達并促進TSPCs向骨系分化，利用特異靶向HIF-2α的shRNA降低內(nèi)源HIF-2α表達后，可顯著抑制IL-1β(5ng/ml)處理下TSPCs的骨系分化。肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Sc

12、x轉(zhuǎn)錄啟示序列區(qū)有幾個在脊椎動物中保守的HIF-2α應答元件（HRE），過表達HIF-2α可抑制TSPCs中Scx表達，敲低HIF-2α可逆轉(zhuǎn)IL-1β處理下Scx表達的降低，而過表達Scx可部分抑制過表達HIF-2α導致的TSPCs骨化增強。
　　綜上所述，IL-1β通過激活HIF-2α，從而負向調(diào)控由Scx維持的肌腱系特異基因表達，上調(diào)骨軟骨系基因表達，從而促進TSPCs向骨系分化增強。
　　四、運用小分子調(diào)控TSPCs

13、功能促進肌腱再生研究
　　為了靶向調(diào)控因IL-1β慢性升高產(chǎn)生的炎癥因子平衡破壞導致的TSPCs分化功能異常，從而促進肌腱再生，我們運用小分子阻斷NF-κB和HN-2α信號通路，促進內(nèi)源性TSPCs的腱系分化及肌腱再生。體外結(jié)果顯示，地高辛(digoxin)可抑制炎癥病理環(huán)境下HIF-2α信號通路，促進TSPCs向腱系分化，抑制其骨系分化。肌腱損傷3天后給予地高辛治療能顯著抑制肌腱異位鈣化，促進肌腱修復?；虮磉_檢測顯示地高辛能夠

14、提升Scx表達水平，降低軟骨特異細胞外基質(zhì)膠原Ⅱ表達。提示地高辛體內(nèi)也可調(diào)控內(nèi)源性TSPCs向腱系分化。以往研究顯示姜黃素(curcumin)可抑制NF-κB信號通路。我們的體外實驗顯示，IL-1β刺激下給予姜黃素處理，可促進TSPCs的增殖及維持Scx表達。肌腱損傷3天后，體內(nèi)給予姜黃素治療6周，可提升抗炎癥因子IL-4和IL-10水平，下調(diào)促炎癥因子IL-1α水平，體外實驗顯示，姜黃素處理后的巨噬細胞的條件培養(yǎng)基有助于誘導培養(yǎng)的肌腱

15、組織的Scx表達。組織學分析顯示姜黃素處理提升肌腱細胞外基質(zhì)合成及膠原直徑。提示姜黃素可通過直接作用于TSPCs以及間接調(diào)控炎癥微環(huán)境的平衡促進肌腱修復。
　　綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)在肌腱損傷后的急性炎癥反應時期，促炎癥因子IL-1β和抑炎癥因子IL-4和IL-10序貫性地上調(diào)，可促進肌腱干細胞(TSPCs)階段性地增殖及腱系分化;而慢性病理肌腱組織中促炎癥因子IL-1β長期上調(diào)而抑炎癥因子IL-4和IL-10長期下調(diào)，導致炎癥微環(huán)境

16、的失衡。TSPCs的肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Scx表達下調(diào)、腱系分化能力下降但骨系分化能力增強，參與了肌腱異位鈣化的形成。在機制分析中，我們通過體內(nèi)外實驗證明，IL-1β刺激可上調(diào)HIF-2α信號通路，抑制肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子Scx及肌腱特異基因表達，從而導致TSPCs異常分化形成肌腱異位骨化。同時，我們發(fā)現(xiàn)運用小分子藥物地高辛可調(diào)控內(nèi)源TSPCs對于慢性炎癥微環(huán)境的響應，抑制其骨系分化并促進其向腱系分化;而姜黃素可同時調(diào)控失衡的炎癥微環(huán)境及TSP