胚胎干細(xì)胞與蠶絲-膠原支架促進(jìn)肌腱再生的研究.pdf

1、背景：
　　 隨著國(guó)民素質(zhì)的提高以及人們對(duì)健康的追求，體育鍛煉和競(jìng)賽活動(dòng)明顯增加，以及由于意外事故不斷發(fā)生和社會(huì)老齡化趨勢(shì)日益明顯，運(yùn)動(dòng)損傷也越來(lái)越多，其中韌帶肌腱損傷占50％以上。統(tǒng)計(jì)表明，每年至少有3000萬(wàn)的肌腱損傷病例。目前，臨床上對(duì)肌腱損傷的治療主要停留在理療、手術(shù)縫合以及自體或異體移植階段，雖有一定效果，但是療效有限，即使是自體肌腱移植修復(fù)也只能達(dá)到正常肌腱力學(xué)性能的40％左右，且伴隨有大量疤痕組織增生。這主要是因?yàn)?/p>

2、成體肌腱不具備完全再生能力，所以修復(fù)后肌腱的質(zhì)量遠(yuǎn)不如正常肌腱，易出現(xiàn)肌腱粘連，肌腱結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能低下，常重復(fù)斷裂。因此，尋找新型的、可促進(jìn)肌腱生理性再生修復(fù)的方法具有極其重要的臨床意義。
　　 隨著最近10年組織工程和干細(xì)胞研究的興起，使臨床醫(yī)學(xué)步入了“再生醫(yī)學(xué)”的新階段。通過(guò)利用干細(xì)胞復(fù)合支架材料的組織工程手段，促使身體自主再生已損傷組織，為提高肌腱等軟組織的修復(fù)質(zhì)量帶來(lái)了全新的機(jī)會(huì)。肌腱組織工程技術(shù)中包含三個(gè)重要的迫切需要

3、解決的關(guān)鍵問(wèn)題：1）獲得足夠分化成熟的肌腱種子細(xì)胞；2）能夠提供足夠生長(zhǎng)空間的生物支架材料；3）種子細(xì)胞分化的力學(xué)刺激以及其他轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。然而，目前這些問(wèn)題尚未解決，影響了肌腱組織工程的發(fā)展，從而制約了組織工程肌腱在臨床用于肌腱缺損再生修復(fù)治療。本研究針對(duì)目前這些現(xiàn)狀，旨在系統(tǒng)的研究組織工程肌腱所面臨的三個(gè)迫切問(wèn)題，最終目的為復(fù)合誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞與蠶絲-膠原海綿支架構(gòu)建組織工程肌腱并促進(jìn)肌腱損傷的再生。研究?jī)?nèi)容包含：在種子細(xì)胞選擇

4、、分化和調(diào)控方面，擬采用分子生物學(xué)手段調(diào)控誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞階段性向肌腱細(xì)胞分化以提供足夠的種子細(xì)胞，并闡明力學(xué)和轉(zhuǎn)錄因子因素調(diào)控干細(xì)胞肌腱分化的機(jī)理和協(xié)同效果，獲得有效的肌腱分化條件；本方向的進(jìn)一步研究將為肌腱分化及再生提供全新的思路和知識(shí)，為認(rèn)知肌腱再生的生物機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論數(shù)據(jù)，為運(yùn)用特定分化后肌腱干細(xì)胞用于肌腱再生打下基礎(chǔ)。在組織工程支架方面，擬研發(fā)一個(gè)既符合組織工程支架需要，又具有生理承載功能的可抗拉力的功能性肌腱支架--

5、蠶絲-膠原海綿復(fù)合支架，使之更符合肌腱生物學(xué)特性和力學(xué)特性。最終將利用研發(fā)的支架復(fù)合誘導(dǎo)的人胚胎干細(xì)胞，構(gòu)建組織工程肌腱，通過(guò)動(dòng)物模型評(píng)估組織工程肌腱對(duì)肌腱損傷修復(fù)的再生作用。本研究課題，將最終為組織工程肌腱應(yīng)用于臨床打下基礎(chǔ)，為肌腱損傷治療帶來(lái)新的方向。
　　 由于肌腱與韌帶在結(jié)構(gòu)與功能上類似，因此，在本課題中肌腱組織工程泛指肌腱與韌帶組織工程。
　　 本研究分為四個(gè)部分：（1）人胚胎干細(xì)胞(hESCs)誘導(dǎo)成為間質(zhì)干

6、細(xì)胞(MSCs)，并應(yīng)用于肌腱組織工程研究，探索hESCs促進(jìn)肌腱再生的可行性和功效性；（2）研究肌腱發(fā)育特征轉(zhuǎn)錄因子SCX對(duì)hESCs來(lái)源MSCs的肌腱分化影響。闡明SCX對(duì)hESC-MSCs的肌腱分化調(diào)控，并獲得SCX+的肌腱祖細(xì)胞。在獲得SCX+肌腱祖細(xì)胞的基礎(chǔ)上研究外加力學(xué)刺激與轉(zhuǎn)錄因子對(duì)肌腱分化的協(xié)同效應(yīng)以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控機(jī)理，明確肌腱祖細(xì)胞向肌腱分化調(diào)控機(jī)制；（3）構(gòu)建網(wǎng)狀蠶絲-膠原海綿復(fù)合支架，評(píng)估該支架用于肌腱

7、/韌帶組織工程的可行性與優(yōu)勢(shì)。（4）支架復(fù)合誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞構(gòu)建組織工程肌腱，在動(dòng)物模型中評(píng)估工程化的細(xì)胞與支架構(gòu)成的組織工程肌腱對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。
　　 第一章：人胚胎干細(xì)胞的階段性分化通過(guò)分泌胚胎肌腱基質(zhì)和分化因子促進(jìn)肌腱再生
　　 目的：人胚胎干細(xì)胞(hESCs)是組織再生的理想種子細(xì)胞，但是至今尚未有研究報(bào)道人胚胎干細(xì)胞用于肌腱再生的可能性。本課題主要研究人胚胎干細(xì)胞用于肌腱再生的策略和功效，以及相關(guān)的

8、機(jī)理。
　　 方法與結(jié)果：首先，將人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，這種MSC具有三系分化潛能并且表達(dá)MSC的表面標(biāo)記。通過(guò)肌腱特異性基因的表達(dá)和肌腱結(jié)構(gòu)鑒定證明人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hESC-MSCs)不僅在體外組織工程模型還是在體內(nèi)異位肌腱再生模型中都可以再生肌腱組織。在大鼠原位髕腱修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，用hESC-MSCs處理組與對(duì)照組相比具有較好的組織結(jié)構(gòu)和力學(xué)性能。另外，hESC-MSCs可以在肌腱損傷區(qū)域

9、存活至少4周，并且分泌人胚胎肌腱特異的胞外基質(zhì)成分和分化因子，這些因子進(jìn)一步激活肌腱內(nèi)源的再生過(guò)程。并且，在所有樣本中均未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤形成。
　　 結(jié)論：本研究開(kāi)創(chuàng)了一種安全有效的將胚胎干細(xì)胞用于肌腱再生的方法，并有助于發(fā)展未來(lái)應(yīng)對(duì)肌腱疾病的手段。
　　 第二章：轉(zhuǎn)錄因子scleraxis與力學(xué)刺激協(xié)同調(diào)控干細(xì)胞腱系分化機(jī)理和效應(yīng)研究
　　 目的：缺乏肌腱分化調(diào)控知識(shí)是實(shí)現(xiàn)肌腱再生的根本性難題。發(fā)育生物學(xué)是分化研究

10、的線索。已有肌腱發(fā)育分化研究發(fā)現(xiàn)：1）SCX是肌腱祖細(xì)胞的標(biāo)志，TGF，F(xiàn)GF是肌腱發(fā)育的關(guān)鍵通路，而目前從SCX+祖細(xì)胞到肌腱的分化調(diào)控知識(shí)缺乏；2）SCX是肌腱發(fā)育的必要但不充分條件，敲除SCX出現(xiàn)嚴(yán)重的肌腱缺失；3）肌腱發(fā)育過(guò)程提示存在力學(xué)刺激促肌腱成熟現(xiàn)象。而力學(xué)與SCX在肌腱成熟和分化中的協(xié)同作用及相應(yīng)機(jī)制仍未清楚。本章主要研究SCX+祖細(xì)胞向成熟肌腱細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制，即以SCX+干細(xì)胞為起點(diǎn)復(fù)合力學(xué)刺激誘導(dǎo)肌腱分化，明確SC

11、X與力學(xué)刺激對(duì)肌腱分化是否有協(xié)同作用并探索其機(jī)制。
　　 方法與結(jié)果：第一階段將肌腱發(fā)育特征轉(zhuǎn)錄因子SCX轉(zhuǎn)入hESC來(lái)源MSCs，獲得SCX+的肌腱祖細(xì)胞。第二階段將在SCX+肌腱祖細(xì)胞構(gòu)建的細(xì)胞片的基礎(chǔ)上研究外加周期性力學(xué)刺激(1Hz)，并揭示力學(xué)與轉(zhuǎn)錄因子對(duì)肌腱分化的協(xié)同效應(yīng)以及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的協(xié)同調(diào)控機(jī)理，明確肌腱祖細(xì)胞向肌腱分化調(diào)控機(jī)制。第三階段，評(píng)估SCX復(fù)合力學(xué)分化的肌腱細(xì)胞修復(fù)再生修復(fù)肌腱的效率。實(shí)驗(yàn)表明：1）S

12、CX可增加肌腱細(xì)胞外基質(zhì)（膠原Ⅰ，XIV）表達(dá)，并降低膠原Ⅱ表達(dá)及BMP活性。然而，SCX亦能增加runx2表達(dá)及骨誘導(dǎo)效果。2）在力學(xué)協(xié)同刺激下，SCX可增加肌腱特異性基因表達(dá)而誘導(dǎo)肌腱分化。3）體內(nèi)異位種植及原位修復(fù)結(jié)果顯示，SCX與力學(xué)有協(xié)同誘導(dǎo)分化及修復(fù)作用，可誘導(dǎo)膠原纖維成熟，并促進(jìn)肌腱修復(fù)。
　　 結(jié)論：該研究表明SCX與力學(xué)不僅在肌腱分化中有重要作用，并且能夠協(xié)同作用誘導(dǎo)肌腱分化與修復(fù)。SCX與力學(xué)刺激的協(xié)同作用部

13、分是通過(guò)調(diào)控BMP-Smad通路及runx2的功能。該研究發(fā)現(xiàn)將為肌腱分化調(diào)控提控新知識(shí)，并將可能通過(guò)更準(zhǔn)確調(diào)控干細(xì)胞腱系分化為肌腱再生的新的種子細(xì)胞和手段。
　　 第三章：網(wǎng)狀蠶絲-膠原海綿復(fù)合支架促肌腱再生研究
　　 目的：本課題致力于發(fā)明一種力學(xué)性能和生物學(xué)性能良好的生物材料，為肌腱韌帶組織工程提供一種同時(shí)具備有良好力學(xué)性能和足夠相通的細(xì)胞組織容納空間的支架，即網(wǎng)狀蠶絲復(fù)合膠原海綿支架。
　　 方法與結(jié)果：

14、該支架用于韌帶肌腱組織工程的功效性通過(guò)體外和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。在膠原基質(zhì)上培養(yǎng)的細(xì)胞與生長(zhǎng)在蠶絲上的細(xì)胞高表達(dá)肌腱韌帶的胞外基質(zhì)基因。小鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蠶絲支架有很好的生物相容性，并會(huì)緩慢的降解。兔內(nèi)側(cè)副韌帶損傷模型顯示，將網(wǎng)狀蠶絲復(fù)合膠原海綿支架用于內(nèi)側(cè)副韌帶的修復(fù)得到更多的膠原沉積和更好的力學(xué)性能，與未修復(fù)和單純蠶絲支架修復(fù)效果相比，實(shí)驗(yàn)組超微結(jié)構(gòu)的膠原直徑更大且支架和肌腱的交界點(diǎn)修復(fù)更強(qiáng)。
　　 結(jié)論：本研究結(jié)果證明

15、了網(wǎng)狀蠶絲復(fù)合膠原海綿支架通過(guò)調(diào)控肌腱韌帶胞外基質(zhì)基因的表達(dá)和膠原纖維的聚合促進(jìn)了肌腱結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。這些發(fā)現(xiàn)第一次強(qiáng)調(diào)了生物材料在肌腱韌帶再生生物學(xué)中的重要角色。另外，“內(nèi)部空間預(yù)留”的支架概念的提出有利于處于力學(xué)張力下組織的修復(fù)。
　　 第四章：基因工程化hESC-MSC與蠶絲-膠原海綿復(fù)合支架構(gòu)建組織工程肌腱研究
　　 目的：我們之前的研究中已證明復(fù)合了膠原的蠶絲支架在肌腱再生中擁有良好的潛能，并證實(shí)hESC-M

16、SCs及SCX+hESC-MSCs在肌腱分化及促進(jìn)修復(fù)肌腱再生中的潛能。本研究旨在應(yīng)用支架復(fù)合誘導(dǎo)后的胚胎干細(xì)胞構(gòu)建組織工程肌腱，在動(dòng)物模型中評(píng)估工程化的細(xì)胞與支架構(gòu)成的組織工程肌腱對(duì)肌腱損傷修復(fù)的促進(jìn)作用。
　　 方法與結(jié)果：體外實(shí)驗(yàn)將hESC-MSC及工程化SCX+hESC-MSC種在復(fù)合支架上在體外施以動(dòng)態(tài)力學(xué)刺激(DM)或無(wú)力學(xué)刺激(NM)達(dá)14天。體內(nèi)異位種植則埋入裸鼠皮下4周，部分通過(guò)將構(gòu)建物縫合在裸鼠背部脊上韌帶施

17、以天然的力學(xué)刺激(DM)，其他的則不受力(NM)。原位跟腱修復(fù)分別于固定后2周，4周，進(jìn)行大體、組織學(xué)、超微結(jié)構(gòu)、生化組成、生物力學(xué)檢測(cè)。力學(xué)刺激誘導(dǎo)了復(fù)合膠原蠶絲支架上的hESC-MSC及SCX+hESC-MSC向肌腱方向分化，體內(nèi)異位移植肌腱的組織學(xué)、生化組成和膠原表達(dá)、膠原纖維大小均大于無(wú)力學(xué)組，兩種細(xì)胞間差異并不明顯。肌腱修復(fù)結(jié)果顯示細(xì)胞促進(jìn)形成更成熟的膠原纖維，并促進(jìn)損傷肌腱的修復(fù)。另外SCX+hESC-MSC可促進(jìn)修復(fù)肌腱的