LAG-3抑制性共刺激分子和慢性HBV感染關(guān)系的研究.pdf

1、背景和目的
　　淋巴細(xì)胞活化基因-3分子(lymphocyte activation gene-3，LAG-3)是一種獨(dú)立免疫負(fù)調(diào)節(jié)分子，具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和參與免疫調(diào)節(jié)的功能，與慢性病毒感染導(dǎo)致的CD8+T細(xì)胞耗竭密切相關(guān)。慢性乙型肝炎的發(fā)病機(jī)理主要是一種免疫病理反應(yīng)，HBV持續(xù)感染與特異性CD8+T淋巴細(xì)胞應(yīng)答功能低下有關(guān)。本文主要探討LAG-3與慢性乙肝疾病進(jìn)展的關(guān)系，為尋求新的抗病毒治療策略提供新的思路。
　　對象和

2、方法
　　1研究對象
　　篩選2012年2月-2013年6月在浙江大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染科門診和住院HBV感染者90例，同時以18例正常健康人作為對照組，結(jié)合臨床資料將其分為三組，分別為:慢性乙型肝炎患者組、慢性無癥狀HBV攜帶者組及正常對照組。
　　2實(shí)驗(yàn)方法
　　1)外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)分離空腹靜脈采集全血標(biāo)本，采用Ficoll淋巴細(xì)

3、胞分離液分離PBMC。
　　2)CD8+T淋巴細(xì)胞CD223的測定采用流式細(xì)胞技術(shù)測CD8+T淋巴細(xì)胞CD223(LAG-3)表達(dá)。
　　3)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的測定采用流式細(xì)胞技術(shù)測定，通過破膜、染色，測定表達(dá)或不表達(dá)LAG-3的CD8+T細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ的分泌差異。
　　4)LAG-3抗體阻斷對淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ的影響（ELISPOT法）。
　　5)HBV病毒學(xué)指標(biāo)的檢測HBsAg、抗HBs、HBe

4、Ag、抗HBe及抗HBc采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫法(CMIA)檢測;HBV-DNA定量采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測，截止值為103拷貝/ml。
　　6)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)測定使用HITACHI7600-110型全自動生化分析儀測定。
　　7)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包及GraphPad Prism5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
　　結(jié)果
　　1)慢乙肝患者組淋巴細(xì)胞表面CD8+CD

5、223+分布頻數(shù)明顯高于正常對照組和慢性HBV攜帶者組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2)慢乙肝患者中ALT高DNA低組和ALT高DNA高組淋巴細(xì)胞表面CD8+CD223+分布頻數(shù)明顯高于正常對照組(P＜0.05)。而慢乙肝患者中ALT低DNA低組、ALT低DNA高組淋巴細(xì)胞表面CD8+CD223+分布頻數(shù)與正常對照組比，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3)慢乙肝患者組及慢性HBV攜帶者組表面CD8+CD223分

6、布頻數(shù)與相應(yīng)的ALT水平有明顯的正相關(guān)性。（P=0.03，r=0.23）。
　　4)慢乙肝患者PBMC中，IFN-γ+在CD8+CD223-細(xì)胞的分布頻數(shù)明顯高于其在CD8+CD223+細(xì)胞的分布頻數(shù)(P=0.02)。
　　5)慢乙肝患者PBMC在乙肝核心抗原及CD223抗體的作用下斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)明顯高于乙肝核心抗原刺激組(P＜0.01)、乙肝核心抗原加同型IgG組(P＜0.01)及乙肝核心抗原加PD-L1組(P=0.01)

7、;慢乙肝患者PBMC在乙肝核心抗原加PD-L1及CD223抗體作用下斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)明顯高于乙肝核心抗原加PD-L1組(P=0.03)而其與乙肝核心抗原加CD223抗體組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論
　　1)慢性乙肝患者外周血CD8+T細(xì)胞表面LAG-3表達(dá)明顯增加，且與肝臟炎癥程度成正相關(guān)，而與HBV DNA載量無關(guān)。
　　2)慢性乙肝患者中，高表達(dá)LAG-3的CD8+T細(xì)胞功能受損，表現(xiàn)為其分泌細(xì)胞因子I