共刺激分子mRNA表達(dá)水平與衰老及腫瘤關(guān)系的研究.pdf

1、目的：構(gòu)建含共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL等目的基因片段的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，建立檢測(cè)這些共刺激分子mRNA表達(dá)水平的Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法。并檢測(cè)上述共刺激分子在不同年齡段健康人及癌癥患者中的表達(dá)情況，探討共刺激分子與衰老及腫瘤的關(guān)系。
　　 方法：第一部分：以從一例組織（胃腺癌）中提取的總RNA為模板、Random9 mers為引物反轉(zhuǎn)錄合成c1NA，用該cDNA為模

2、板PCR擴(kuò)增人CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL的目的基因表達(dá)片段，構(gòu)建PBS-TⅡ/CD28/CTLA-4/CD86/CD40L ICOS/ICOSI/β-ACTIN重組質(zhì)粒，鑒定測(cè)序后，用Taqman探針熒光定量PCR制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。
　　 第二部分：收集165例（20-88歲）健康人外周血標(biāo)本，按不同年齡段分為6組，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的方法檢測(cè)共刺激分子CD28、CTLA-4、CD86

3、、CD40L、ICOS、ICOSL mRNA在不同年齡段健康人群外周血的表達(dá)量并進(jìn)行比較，以探討共刺激分子與衰老的關(guān)系。
　　 第三部分：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的方法檢測(cè)共刺激分子CD28、CTLA-4、ICOS、ICOSLmRNA在食管癌及肺癌患者外周血的表達(dá)量，并檢測(cè)比較ICOS/ICOSLmRNA在胃腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織的表達(dá)量。
　　 結(jié)果：第一部分：組織提取的總RNA完整性良好，構(gòu)建的CD28、CTLA4

4、、CD86、CD40L、ICOS、ICOSI，重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與目的片段一致，原始質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋后用Taqman探針熒光定量PCR檢測(cè)，CTLA-4、CD86質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在E12-E4copies/mL，CD28、CD40L、ICOS、ICOSL，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品在E12-E3 copies/mL線性關(guān)系良好（R2=1）。
　　 第二部分：（1）各年齡段中不同性別的每種共刺激分子的mRNA表達(dá)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）健康人外周血中

5、CD28、ICOS mRNA的表達(dá)水平隨著年齡的增加降低，而CTLA-4 mRNA表達(dá)情況則相反。（3）健康人外周血中CD86、CD40L、ICOSImRNA的表達(dá)水平與年齡無相關(guān)性（P>0.05）。
　　 第三部分：（1）51-70歲年齡段的食管癌及肺癌患者外周血中CD28、ICOS、CTLA-4mRNA的表達(dá)水均低于健康人。（2）胃腺癌組織中ICOS mRNA表達(dá)水平低于相應(yīng)癌旁組織。（3）CD28、CD40L、ICOS、I

6、COSLmRNA的表達(dá)量在不同臨床分期、癌的類型、分化程度及有無淋巴轉(zhuǎn)移等的分組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 結(jié)論：1.成功建立Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)CD28、CTLA-4、CD86、CD40L、ICOS、ICOSL，基因表達(dá)的方法。
　　 2.隨著年齡增加共刺激分子基因表達(dá)水平的變化可能與衰老的發(fā)生及發(fā)展有關(guān)。
　　 3.癌癥患者外周血或組織中活化性共刺激分子基因表達(dá)水平的降低，可能是腫瘤