Microvesicles與非瓣膜性心房顫動(dòng)血栓前狀態(tài)關(guān)系的研究.pdf

1、論文Ⅰ、Microvesicles與非瓣膜性心房顫動(dòng)血栓前狀態(tài)關(guān)系的臨床研究
　　 研究背景：
　　 非瓣膜性心房顫動(dòng)（房顫）是腦卒中及血栓栓塞事件強(qiáng)烈的獨(dú)立危險(xiǎn)因素?？鼓委熓穷A(yù)防房顫卒中最為有效的手段，但仍然有33％-38％的卒中不能被防治，提示非瓣膜性房顫患者血栓形成的機(jī)制復(fù)雜，可能與房顫的基礎(chǔ)病因相關(guān)。晚近，人們認(rèn)為，血小板活化是高凝狀態(tài)及血栓形成的始動(dòng)因素。一系列凝血因子借助活化血小板的磷脂表面為反應(yīng)平臺(tái)，通過

2、級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)產(chǎn)生了數(shù)量龐大的凝血酶，最終形成血栓。
　　 但是以抗血小板作為首選的治療方案同樣受到以往研究的挑戰(zhàn)。與安慰劑相比，阿司匹林可使房顫患者血栓栓塞的相對(duì)危險(xiǎn)降低21％，其效果顯著低于華法林。其中最重要的原因之一就是與血小板激活途徑的多樣性有關(guān)。事實(shí)上非瓣膜性房顫中血小板被激活的機(jī)制尤其是被房顫基礎(chǔ)病因激活的機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明。
　　 近期的研究強(qiáng)調(diào)了炎癥、氧化應(yīng)激以及代謝紊亂在非瓣膜性房顫血栓前狀態(tài)形成

3、中的潛在作用。上述研究分別提供了各自獨(dú)立的證據(jù)，卻無法將這些導(dǎo)致高凝狀態(tài)的各種機(jī)制作為一個(gè)整體進(jìn)行系統(tǒng)性研究，使治療缺乏特異性。因此，尋找一種能夠同時(shí)承載上述啟動(dòng)血小板活化的各種機(jī)制的載體，以此為工具深入研究房顫時(shí)血栓前狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制，將為探索房顫時(shí)血栓前狀態(tài)綜合防治的新的有效靶點(diǎn)提供依據(jù)。晚近有關(guān)microvesicles（微囊泡）的研究為我們提供了線索。
　　 Microvesicles是由激活或凋亡的多種細(xì)胞通過分泌或脫落

4、的形式釋放到細(xì)胞外的小囊泡體。其中，與高凝狀態(tài)和血栓形成關(guān)系最為密切的是血小板源的microvesicles，其在促凝的同時(shí)攜帶了多種血小板活化的信息。由此，我們推測，血小板來源的microvesicles是房顫時(shí)傳遞血小板活化信息的重要載體，是啟動(dòng)凝血過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。已有研究證實(shí)，microvesicles的強(qiáng)促凝活性主要依賴于其表達(dá)的PS（與AnnexinⅤ有很強(qiáng)的親和力），而血小板膜糖蛋白CD36是PS的主要受體。CD36屬于B類

5、清道夫受體，是一種細(xì)胞膜表面單鏈糖蛋白，廣泛存在于單核細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中。CD36可與多種配體結(jié)合，通過與不同配體的結(jié)合，在多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用。因此，我們推測，在非瓣膜性房顫各組基礎(chǔ)病因環(huán)境下，microvesicles是通過與血小板膜CD36結(jié)合途徑活化血小板，并以級(jí)聯(lián)放大的方式啟動(dòng)血栓前狀態(tài)或高凝狀態(tài)。迄今為止，國內(nèi)外尚缺乏這方面的研究。因此，本課題擬采用病例對(duì)照研究，以正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫腦卒中中低

6、危組及非瓣膜性房顫腦卒中高危組的臨床患者為研究對(duì)象，篩選出調(diào)控microvesicles特別是血小板源的microvesicles的各種危險(xiǎn)因素;研究血小板源microvesicles和AnnexinⅤ陽性的microvesicles的表達(dá)及其與血小板活化指標(biāo)的相關(guān)性;探討血小板膜CD36的表達(dá)情況及其與microvesicles、血小板活化指標(biāo)的相關(guān)性。
　　 研究目的：
　　 1.非瓣膜性房顫狀態(tài)下，篩選出調(diào)控血小板

7、源microvesicles釋放的各種危險(xiǎn)因素;
　　 2.非瓣膜性房顫患者血小板源microvesicles和AnnexinⅤ陽性的microvesicles的表達(dá)及其與房顫腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系;
　　 3.非瓣膜性房顫患者血小板膜糖蛋白CD36的表達(dá)水平及其與房顫腦卒中風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系;
　　 4.探討在非瓣膜性房顫狀態(tài)下，血小板來源的microvesicles和AnnexinⅤ陽性的microvesicles的水平，

8、血小板膜糖蛋白CD36的表達(dá)，血小板活化指標(biāo)等各因素之間的相關(guān)性及內(nèi)在聯(lián)系。
　　 研究對(duì)象與方法：
　　 選擇陣發(fā)性或持續(xù)性非瓣膜性房顫患者210例進(jìn)行病例一對(duì)照研究，平均年齡62.23±11.47歲，男性127例，女性83例。正常對(duì)照組35例，平均年齡55.71±7.43歲，男性17例，女性18例，均來自健康人群志愿者。對(duì)所有參與者進(jìn)行體格檢查，記錄年齡、性別，測量身高、體重、腰圍、臀圍和血壓等，并詢問現(xiàn)病史、既往史

9、、煙酒史、用藥史和家族史等。部分參與者進(jìn)行了超聲心動(dòng)圖和頸動(dòng)脈超聲檢查。所有參與者均經(jīng)隔夜禁食12～14小時(shí)，次日清晨抽取空腹肘靜脈血，測定血常規(guī)、葡萄糖(GLU)、總膽固醇(cholesterol，Cho)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-c)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-c)、尿酸(UA)等指標(biāo);采用ELISA法檢測血漿中8-表氧-前列腺素F2α(8-iso-prostaglandinF2α)、氧化型低密度脂蛋白(ox

10、-LDL)、白介素6(IL-6)、晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)及可溶性P選擇素(P-selectin)的水平;固相免疫吸附法檢測血小板源的microvesicles及AnnexinⅤ陽性的microvesicles;采用流式細(xì)胞術(shù)測定血小板血小板膜CD36和血小板糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.非瓣膜性房顫患者卒中風(fēng)險(xiǎn)分層:
　　 所有入選的非瓣膜性房顫患者根據(jù)CHADS2卒中危險(xiǎn)評(píng)分

11、標(biāo)準(zhǔn)分為腦卒中高危組和中低危組。CHADS2評(píng)分參數(shù)包括:充血性心力衰竭、高血壓、年齡＞75歲、糖尿病、既往卒中或TIA史，前四項(xiàng)危險(xiǎn)因素各1分，最后一項(xiàng)危險(xiǎn)因素為2分。CHADS2評(píng)分總分為6分，0～1分為中低危組，2～6分為高危組。所有房顫患者中，113例(53.81％)屬于卒中高危組（平均年齡:66.68±10.46歲，男性62例，女性51例），97例(46.19％)屬于卒中中低危組（平均年齡:57.05±10.41歲，男性65例

12、，女性32例）。
　　 2.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中低危組及高危組臨床特征的比較:
　　 (1)正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫腦卒中中低危組及高危組間性別、體重指數(shù)、舒張壓、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C和血小板計(jì)數(shù)均無顯著性差異(P＞0.05)。
　　 (2)正常對(duì)照組和非瓣膜性房顫腦卒中中低危組之間年齡、性別、體重指數(shù)、舒張壓、空腹血糖、膽固醇、甘油三酯、LDL-C、HDL-C、尿酸、血肌酐和血小板

13、計(jì)數(shù)差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;與對(duì)照相比，中低危組患者收縮壓、腰臀比顯著增高(P＜0.01)。
　　 (3)按照CHADS2卒中危險(xiǎn)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，非瓣膜性房顫卒中高危組除年齡較大外，其心衰、高血壓、糖尿病及卒中史的發(fā)生率也遠(yuǎn)高于正常對(duì)照組和非瓣膜性房顫腦卒中中低危組（P＜0.001）;此外，高危組患者的收縮壓、空腹血糖、血肌酐、白細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)較對(duì)照組和中低危組顯著增高（P＜0.01）;高危組患者腰臀比較對(duì)照組顯著增高(P

14、＜0.001)，較中低危組無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 3.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中低危組及高危組臨床用藥情況的比較:
　　 與中低危組相比，非瓣膜性房顫卒中高危組華法林、鈣通道阻滯劑、β受體阻斷劑和它汀類藥物的應(yīng)用比例無顯著差異（P＞0.05），但是阿司匹林、ACEI/ARB的應(yīng)用比例顯著增高(P＜0.01)。正常對(duì)照組未用任何上述心血管疾病治療相關(guān)藥物。
　　 4.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中

15、低危組及高危組超聲指標(biāo)的比較:
　　 (1)超聲心動(dòng)圖結(jié)果顯示:非瓣膜性房顫卒中中低危組患者與正常對(duì)照組之間IVST、LVPWT及LVEF差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是中低危組患者LAD、RAD、E/E’及PCWP均有明顯升高(P＜0.01);非瓣膜性房顫卒中高危組患者與正常對(duì)照組相比LVEF顯著降低(P＜0.01)，LAD、RAD、IVST、LVPWT、E/E’及PCWP顯著升高（P＜0.01）;與中低危組相比，高危組LVEF降低（P

16、＜0.05）、E/E’升高(P＜0.05)，LAD、RAD、IVST、LVPWT及PCWP均無顯著差異。
　　 (2)頸動(dòng)脈超聲發(fā)現(xiàn)，非瓣膜性房顫卒中中低危組患者IMT及斑塊指數(shù)較正常對(duì)照明顯增高(P＜0.01);與正常對(duì)照相比，高危組患者IMT及斑塊指數(shù)顯著增高（P＜0.001）;與中低危組相比，高危組患者IMT無顯著差異，但是斑塊指數(shù)顯著增高(P＜0.05)。
　　 5.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中低危組及高危組氧

17、化應(yīng)激、炎癥等指標(biāo)的比較:
　　 (1)非瓣膜性房顫卒中中低危組患者血漿中氧化應(yīng)激指標(biāo)oxLDL、8-iso-PGF2α較正常對(duì)照組顯著升高(P＜0.01);房顫卒中高危組患者血漿oxLDL、8-iso-PGF2α水平較正常對(duì)照及中低危組房顫患者均明顯升高（P＜0.05）。
　　 (2)房顫卒中中低危組患者血漿中IL-6水平較正常對(duì)照組明顯升高(P＜0.05);高危組患者血漿IL-6水平較正常對(duì)照及中低危組均顯著升高(P

18、＜0.001)。
　　 (3)AGEs是糖代謝紊亂的產(chǎn)物及指標(biāo)。房顫卒中中低危組患者血漿中AGEs水平較正常對(duì)照組明顯升高（P＜0.001）;高危組患者血漿AGEs水平較正常對(duì)照組及中低危組均顯著升高(P＜0.01)。
　　 6.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中低危組及高危組microvesicles水平的比較:
　　 與正常對(duì)照組相比，非瓣膜性房顫腦卒中中低危組患者血小板來源的microvesicles(PMVs

19、)及AnnexinⅤ陽性的PMVs含量均增高(P＜0.01);與對(duì)照組相比，房顫卒中高危組患者PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs含量顯著增高(P＜0.001);此外，高危組患者PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs含量較中低危組有所增高(P＜0.01)。
　　 7.正常對(duì)照組、非瓣膜性房顫卒中中低危組及高危組血小板相關(guān)指標(biāo)的比較:
　　 (1)與正常對(duì)照組相比，非瓣膜性房顫房顫卒中中低危組患者血小板膜蛋白CD36

20、的表達(dá)顯著增強(qiáng)（P＜0.001）;房顫卒中高危組患者血小板膜蛋白CD36的表達(dá)較正常對(duì)照及中低危組明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　 (2)血小板活化狀態(tài)的檢測包括流式細(xì)胞術(shù)測定血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及ELISA測定血漿中可溶性P-selectin的水平。與對(duì)照組相比，中低危組患者血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin水平均顯著增高（P＜0.001）;高危組患者血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-select

21、in水平較正常對(duì)照組（P＜0.001）或中低危組患者均顯著增高(P＜0.05)。
　　 8.CHADS2評(píng)分與血小板活化指標(biāo)的相關(guān)分析
　　 CHADS2評(píng)分與血小板活化指標(biāo)GPⅡb/Ⅲa相關(guān)（r=0.264，P＜0.001）;CHADS2評(píng)分與血小板可溶性P-selectin的分泌亦密切相關(guān)（r=0.448，P＜0.001），提示非瓣膜性房顫患者腦卒中高風(fēng)險(xiǎn)與血小板激活密切相關(guān)。
　　 9.CHADS2評(píng)分與m

22、icrovesicles的相關(guān)分析
　　 CHADS2評(píng)分與血漿中PMVs水平相關(guān)（r=0.213，P＜0.001）;CHADS2評(píng)分與AnnexinⅤ陽性的PMVs亦密切相關(guān)(r=0.449，P＜0.001)，提示血漿中PMVs，尤其是AnnexinⅤ陽性的PMVs有可能參與了房顫患者血栓前狀態(tài)的發(fā)生。
　　 10.CHADS2評(píng)分與氧化應(yīng)激、炎癥、糖代謝紊亂等指標(biāo)的相關(guān)性分析
　　 CHADS2評(píng)分與8-is

23、o-PGF2α、ox-LDL（反映氧化應(yīng)激指標(biāo)）相關(guān)(r=0.353，P＜0.001;r=0.338，P＜0.001);CHADS2評(píng)分與炎癥指標(biāo)IL-6密切相關(guān)(r=0.410，P＜0.001);CHADS2評(píng)分與AGEs（糖代謝紊亂相關(guān)指標(biāo)）顯著相關(guān)(r=0.511，P＜0.001），提示氧化應(yīng)激、炎癥及糖代謝紊亂有可能是非瓣膜性房顫患者血栓前狀態(tài)發(fā)生的危險(xiǎn)因素。
　　 11.PMVs與氧化應(yīng)激、炎癥、糖代謝紊亂等指標(biāo)的相關(guān)

24、性分析:
　　 PMVs與8-iso-PGF2α顯著相關(guān)（r=0.320，P＜0.001）;PMVs與IL-6顯著相關(guān)（r=0.150，P=0.027）;PMVs與AGEs相關(guān)（r=0.226，P=0.001）。
　　 12.AnnexinⅤ陽性的PMVs與氧化應(yīng)激、炎癥、糖代謝紊亂等指標(biāo)的相關(guān)性分析:
　　 AnnexinⅤ陽性的PMVs與8-iso-PGF2α相關(guān)(r=0.228，P=0.004);Annex

25、inⅤ陽性的PMVs與ox-LDL顯著相關(guān)(r=0.321，P＜0.001);AnnexinⅤ陽性的PMVs與IL-6相關(guān)（r=0.176，P=0.008）;AnnexinⅤ陽性的PMVs與AGEs相關(guān)(r=0.228，P=0.001)。
　　 13.血漿中可溶性P-selectin與microvesicles的相關(guān)分析:
　　 PMVs與可溶性P-selectin（反映血小板活化指標(biāo)）顯著相關(guān)(r=0.184，P=0.

26、007);AnnexinⅤ陽性的PMVs與可溶性P-selectin相關(guān)（r=0.173，P=0.009），提示PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs可能參與了非瓣膜性房顫狀態(tài)下血小板的活化。
　　 14.血小板CD36與血小板活化指標(biāo)的相關(guān)分析:
　　 血小板CD36的表達(dá)與血小板活化指標(biāo)GPⅡb/Ⅲa顯著相關(guān)(r=0.296，P＜0.001);血小板CD36與可溶性P-selectin亦密切相關(guān)(r=0.248，P

27、＜0.001)。以年齡、收縮壓、BMI、WHR、空腹血糖、膽固醇、血小板計(jì)數(shù)、血小板CD36表達(dá)為自變量，以血小板GPⅡb/Ⅲa為因變量，進(jìn)行逐步回歸多元線性回歸分析，血小板CD36（β=0.314，P=0.011）和BMI（β=0.474，P＜0.001）進(jìn)入方程;以年齡、收縮壓、BMI、WHR、空腹血糖、膽固醇、血小板計(jì)數(shù)、血小板CD36表達(dá)為自變量，以血漿可溶性P-selectin為因變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，血小板CD36(β

28、=0.114,P=0.045)、年齡(β=0.360,P=0.004)和WHR(β=0.501,P＜0.001)進(jìn)入方程。
　　 結(jié)論:
　　 (1)與正常對(duì)照組及腦卒中中低危組患者相比，非瓣膜性房顫卒中高危組具有較高的氧化應(yīng)激、炎癥及AGEs水平;
　　 (2)與正常對(duì)照組及腦卒中中低危組患者相比，非瓣膜性房顫卒中高危組具有較高的PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs水平;
　　 (3)與正常對(duì)照組及

29、腦卒中中低危組患者相比，非瓣膜性房顫卒中高危組具有較高的血小板膜CD36水平及血小板活化水平;
　　 (4)PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs與氧化應(yīng)激、炎癥、AGEs等指標(biāo)密切相關(guān)，提示炎癥、氧化應(yīng)激及AGEs有可能是調(diào)控非瓣膜性房顫狀態(tài)下PMVs釋放的重要因素;
　　 (5)PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs分別與血小板活化指標(biāo)密切相關(guān)，提示PMVs可能是傳遞血小板活化信息的重要載體;
　　 (6

30、)血小板膜CD36與血小板活化指標(biāo)密切相關(guān)，提示血小板CD36作為信號(hào)分子有可能介導(dǎo)非瓣膜性房顫狀態(tài)下血小板激活。
　　 論文Ⅱ
　　 Microvesicles與非瓣膜性心房顫動(dòng)血栓前狀態(tài)關(guān)系的基礎(chǔ)研究
　　 研究背景：
　　 非瓣膜性心房顫動(dòng)（房顫）是腦卒中及血栓栓塞事件最強(qiáng)烈的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。房顫時(shí)血栓前狀態(tài)及血栓的形成是由房顫本身引起的還是由房顫伴隨的基礎(chǔ)病因引起的，目前仍存在爭議。近年來相繼揭曉的

31、有關(guān)房顫治療的臨床研究（AFFIRM、RACE及AF/CHF）證實(shí)，“節(jié)律”控制治療并不優(yōu)于“室率”控制治療，2種方法的卒中發(fā)生率無顯著性差異。此外，孤立性房顫的卒中發(fā)生率不比正常人高。這提示我們，房顫時(shí)血栓前狀態(tài)及血栓的形成并不完全依賴于房顫本身，推測可能是與房顫伴隨的基礎(chǔ)病因有關(guān)。
　　 非瓣膜性房顫的上游疾病如冠心病、高血壓、糖尿病、老齡化等使房顫患者處于較高的炎癥、氧化應(yīng)激水平。高水平的炎癥、氧化應(yīng)激狀態(tài)可顯著加速蛋白質(zhì)

32、、核酸或脂質(zhì)等大分子物質(zhì)的糖基化反應(yīng)，得到的產(chǎn)物即晚期糖基化終產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)。AGEs的形成參與了房顫的發(fā)病機(jī)制，如動(dòng)脈粥樣硬化、心房纖維化等。我們?cè)谡撐蘑裰凶C實(shí)，腦卒中高危的非瓣膜性房顫患者血漿中的氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)及AGEs水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中低?；颊?。綜上，氧化應(yīng)激、炎癥及聚積的AGEs不僅參與了房顫的發(fā)生機(jī)制，而且很可能與房顫時(shí)血栓前狀態(tài)及血栓的形成密切相關(guān)。
　　

33、血小板粘集堆的形成是血栓形成的第一步，活化血小板的磷脂表面為凝血瀑布的激活及纖維蛋白的形成提供了一個(gè)反應(yīng)平臺(tái)?？梢?，血小板在非瓣膜性房顫血栓前狀態(tài)及血栓形成中發(fā)揮著重要作用。房顫發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)病因，如氧化應(yīng)激、炎癥及聚積的AGEs是如何激活血小板導(dǎo)致血栓前狀態(tài)的？至今仍未完全闡明。晚近有關(guān)microvesicles（微囊泡）的研究為我們提供了線索。
　　 Microvesicles是細(xì)胞在活化或凋亡時(shí)從胞膜表面以生芽方式脫落的一

34、些磷脂膜包裹的膜性小囊泡結(jié)構(gòu)，其表面攜帶大量的信息蛋白等，參與多種病理生理過程。血小板源microvesicles(PMVs)是循環(huán)中微囊泡的主要來源，在血栓形成和止血的過程中發(fā)揮重要作用。腦卒中高危的非瓣膜性房顫患者血漿中的PMVs的總量及具有促凝活性的AnnexinⅤ陽性的PMVs的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中低?；颊?。這提示我們，PMVs有可能是承載上述啟動(dòng)血小板活化的各種機(jī)制的載體，將有利于我們研究房顫時(shí)血栓前狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制，從而為探索房顫時(shí)

35、高凝狀態(tài)綜合防治的新的有效靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　 PMVs依靠何種途徑傳遞血小板活化信息？PMVs的強(qiáng)促凝活性主要依賴于其表達(dá)的PS（與AnnexinⅤ有很強(qiáng)的親和力），而血小板膜糖蛋白CD36是PS的主要候選受體之一。因此，PMV-CD36結(jié)合體可能是活化血小板的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。CD36是一種多功能膜受體，廣泛存在于血小板、單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及脂肪細(xì)胞中。它能夠與多種配體結(jié)合，參與多種病理生理過程。PMV-CD36結(jié)合體如何啟動(dòng)血小板

36、的活化過程？Chen等研究發(fā)現(xiàn)，MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)了ox-LDL與血小板表面CD36結(jié)合后激活血小板的過程。深入研究發(fā)現(xiàn)，CD36與oxLDL的結(jié)合是由與oxLDL上的脂質(zhì)成分介導(dǎo)的。蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)microvesicles表面含有大量脂質(zhì)成分。因此，PMV-CD36結(jié)合體活化血小板的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑與ox-LDL激活血小板的過程可能完全相同。由此我們推斷，MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路同樣介導(dǎo)了PMV-CD36結(jié)合體激活血

37、小板的過程。
　　 在非瓣膜性房顫狀態(tài)下，PMVs能否介導(dǎo)房顫基礎(chǔ)病因誘導(dǎo)的血小板激活，從而啟動(dòng)高凝狀態(tài)尚不清楚。因此，我們提出如下假說:非瓣膜性房顫的基礎(chǔ)病因，如氧化應(yīng)激、炎癥或聚集的AGEs，使體內(nèi)PMVs總量增多，通過與血小板膜CD36結(jié)合，啟動(dòng)了PMV-CD36結(jié)合體介導(dǎo)的MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化血小板，從而參與房顫的血栓前狀態(tài)或高凝狀態(tài)的形成。
　　 研究目的：
　　 1.氧化應(yīng)激、炎癥或聚積

38、的AGEs對(duì)PMVs產(chǎn)生的影響;
　　 2.攜帶氧化應(yīng)激、炎癥或AGEs刺激信息的PMVs對(duì)血小板活化的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;
　　 3.PMV-CD36結(jié)合體及其介導(dǎo)的信號(hào)通路作為血栓前狀態(tài)綜合防治的新的有效靶點(diǎn)的可能性。
　　 方法：
　　 1.正常人血小板的分離:健康獻(xiàn)血志愿者均來自本實(shí)驗(yàn)室，近兩周未服用任何抗血小板藥物。志愿者隔夜禁食12～14小時(shí)，次日清晨在輕扎壓脈帶或不扎壓脈帶的情況下，抽取空腹

39、肘靜脈血20mL于0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)的塑料采血管中。常溫下，抗凝血靜置10min后，經(jīng)過120g離心10分鐘后獲得富含血小板血漿(PRP)，后者加入100nmol/LPG-E1后經(jīng)800g離心后得到血小板沉淀。血小板沉淀經(jīng)改良臺(tái)式液（137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，12mmol/LNaHCO3,0.4mmol/LNaH2PO4,5mmol/LHEPES,0.1％Glucose,0.35％BS

40、A，100nmol/LPG-E1，pH7.2)洗滌、重懸。血小板懸液的濃度經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整為1×106/mL，且立即應(yīng)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。
　　 2.氧化應(yīng)激、炎癥及AGEs刺激對(duì)PMVs生成的影響:于37℃條件下，分別采用oxLDL(oxidizedLDL,50μg/mL)、IL-6(1μg/mL)或AGEs(200μg/mL)孵育刺激洗滌血小板懸液(1×106/mL)，同時(shí)各刺激組均設(shè)空白對(duì)照（等量緩沖液）、同型對(duì)照或陽性對(duì)照——

41、二磷酸腺苷刺激(ADP，10μmol/L)。分別采用流式細(xì)胞術(shù)和固相免疫吸附法檢測microvesicles的生成。
　　 3.流式細(xì)胞術(shù)觀察PMVs的釋放:
　　 PMVs免疫熒光標(biāo)記:于BD流式管中先加入5μLPE-cyTM5標(biāo)記抗人CD41a抗體，再加入2.5μL刺激后或未刺激的血小板懸液(1×106/mL)，輕輕混勻后，于常溫下避光孵育15min后，用1mLPBS懸浮細(xì)胞立即上機(jī)檢測。
　　 流式細(xì)胞儀測

42、定及檢測原理:開機(jī)校準(zhǔn)流式細(xì)胞儀后，在CellQuest軟件環(huán)境下，將流式細(xì)胞儀的前向角散射(FSC)，側(cè)向角散射(SSC)及熒光(FL1-FL3)檢測信號(hào)均設(shè)置為對(duì)數(shù)放大，以PE-cyTM5-CD41a陽性為獲取條件，在CD41avs.SSC點(diǎn)圖中設(shè)門找出血小板群圈門，以血小板的位置定位設(shè)門找出PMVs群圈門，計(jì)數(shù)門內(nèi)10，000個(gè)血小板，每管均在同一檢測條件及程序設(shè)定下檢測，數(shù)據(jù)分析采用CellQuest軟件。
　　 4.固

43、相免疫吸附法檢測PMVs的生成
　　 OxLDL、IL-6、AGEs及各組對(duì)照試劑孵育刺激后的血小板懸液，經(jīng)過3，000g離心10min后，上清液再經(jīng)12，000g離心3min以去除血小板的干擾，采用固相免疫吸附法檢測最終上清液的PMVs總量及AnnexinⅤ陽性的PMVs含量。具體步驟同論文Ⅰ。
　　 5.氧化應(yīng)激、炎癥及AGEs刺激條件下PMVs的制備:分別將經(jīng)過oxLDL(50μg/mL)、IL-6（1μg/mL）

44、或AGEs(200μg/mL)孵育刺激后的血小板懸液(1×106/mL)3，000g離心10min后，取上清。上清中加入2.0mmol/L苯甲基黃?；?PMSF)后，于4℃條件下15，000g高速離心60min，此時(shí)獲得的microvesicles沉淀經(jīng)過兩次充分洗滌以去除oxLDL、IL-6或者AGEs的污染，采用BCA法檢測提取的PMVs的蛋白濃度，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 6.雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜蛋白CD36的表達(dá)

45、:在BD流式管內(nèi)加入血小板懸液（2.5μL）與5μL小鼠抗人PEcy5-CD41a，5μL小鼠抗人PE-CD36輕輕混勻;同型對(duì)照管內(nèi)加入等量樣本及小鼠抗人PEcy5-CD41a，5μL小鼠抗人PE-IgM。樣本與抗體在室溫下避光孵育15min后，用1mLPBS重懸細(xì)胞，即刻上機(jī)分析。
　　 7.雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa:分別將步驟5中提取的各種來源的PMVs(30μg/mL)與洗滌血小板懸液(1×10

46、6/mL)于常溫下孵育刺激30min。于BD流式管內(nèi)加入處理后的血小板懸液（2.5μL）與5μL小鼠抗人PEcy5-CD41a，5μLFITC結(jié)合PAC-1抗體(能夠識(shí)別與結(jié)合因血小板激活而異構(gòu)的GPⅡb/Ⅲa)，輕輕混勻后，室溫下避光孵育15min后，用1mLPBS重懸細(xì)胞，即刻上機(jī)分析。
　　 8.比濁法測定血小板聚集:將正常人空腹靜脈血以120g離心10min，小心取出上層血漿為PRP,將取出PRP后的標(biāo)本以3，000g離

47、心10min，其上層較為透明的液體即為PFP。分別計(jì)數(shù)PRP與PFP中的血小板數(shù)，用PFP將PRP中的血小板數(shù)調(diào)節(jié)至25萬/mm3。分別將步驟5中提取的各種來源的PMVs(30μg/mL)與PRP常溫下孵育30min。取225μL的PFP于比濁管中作為空白對(duì)照，取等量的經(jīng)PMVs刺激后的PRP于比濁管內(nèi)，放入一磁棒，在37℃溫育3min后，放入測定儀。用對(duì)照管內(nèi)的PFP調(diào)零后，加入25μLADP的同時(shí)開始記錄，測定時(shí)間為5min，根據(jù)懸

48、液透光度變化的程度及速度即可確定血小板聚集的程度與速度，并同時(shí)記錄下血小板聚集曲線。
　　 9.酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞上清中可溶性P-selectin含量:分別將步驟5中提取的各種來源的PMVs(30μg/mL)與洗滌血小板懸液(1×106/mL)于常溫下孵育刺激30min后，將PMV-血小板混合液3，000g離心10min后取上清，后者再次12，000g離心3min以去除血小板的污染。ELISA法檢測最終細(xì)胞上清液中可溶性P-se

49、lectin含量，操作方法及步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。
　　 10.Westernblot檢測:裂解經(jīng)各種來源PMVs刺激的血小板懸液(1×106/mL)，提取蛋白，westernblot檢測CD36陽性或CD36陰性的血小板內(nèi)磷酸化及非磷酸化的MKK4和JNK的表達(dá)量。
　　 11.丹參酮ⅡA對(duì)PMVs活化血小板的干預(yù)試驗(yàn):在加入各種刺激來源的PMVs(30μg/mL)前，給予洗滌血小板(1×106/mL)不同濃度

50、的丹參酮ⅡA（5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）預(yù)處理15min，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測處理后的血小板表面GPⅡb/Ⅲa及CD36的表達(dá);采用westernblot的方法檢測MKK4/JNK信號(hào)分子的磷酸化水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.PMVs介導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)血小板功能影響的研究
　　 (1)OxLDL能夠促進(jìn)PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs的釋放

51、　　 OxLDL（50μg/mL）及經(jīng)典的血小板激活劑ADP(10μmol/L)在與洗滌血小板(1×106/mL)作用15min后，均能顯著促進(jìn)PMVs的釋放，表現(xiàn)為M門內(nèi)PE-cyTM5-CD41a陽性的微粒數(shù)顯著增多（P＜0.05），但是，天然的未經(jīng)氧化的低密度脂蛋白(nLDL)卻對(duì)PMVs的生成基本無影響。ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組及nLDL相比，oxLDL能夠顯著促進(jìn)PMVs總量及AnnexinⅤ陽性的PMVs的釋放，其作用

52、可與ADP相比(P＜0.05)。
　　 (2)OxLDL依賴的PMVs對(duì)血小板活性的影響
　　 為了驗(yàn)證oxLDL刺激產(chǎn)生的PMVs(oxLDL-PMVs)對(duì)血小板活性的影響，我們將洗滌血小板(1×106/mL)與oxLDL-PMVs(30μg/mL)于常溫下孵育30min。血小板激活以血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa(GPⅡb/Ⅲa)的空間構(gòu)象改變?yōu)樘攸c(diǎn)，從而顯露出纖維蛋白原等粘附分子的識(shí)別與結(jié)合部位，由此導(dǎo)致血小板聚集?？贵w

53、PAC-1能夠識(shí)別并結(jié)合血小板因激活而異構(gòu)的GPⅡb/Ⅲa，是檢測血小板活化最常用的指標(biāo)之一。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，oxLDL-PMVs能夠顯著促進(jìn)血小板PAC-1的平均熒光強(qiáng)度(MFI)增強(qiáng)（P＜0.05），PAC-1陽性的血小板百分率增加(P＜0.05);此外，oxLDL-PMVs能夠明顯促進(jìn)ADP誘導(dǎo)下的血小板的聚集。
　　 (3)OxLDL-PMVs對(duì)CD36陰性的血小板活性的影響
　　 OxLDL-PMVs

54、(30μg/mL)與CD36陰性的血小板(1×106/mL)在常溫下相互作用30min，血小板PAC-1的MFI及陽性百分率都未見明顯變化;血小板聚集率未見明顯增強(qiáng)。
　　 (4)OxLDL-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化呈CD36、磷脂酰絲氨酸(PS)依賴性
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證PMVs表面的PS及血小板表面的CD36對(duì)PMV-血小板相互作用的影響，在oxLDL-PMVs與血小板相互作用之前，我們分別采用CD36中和抗體預(yù)處

55、理洗滌血小板和AnnexinⅤ預(yù)處理oxLDL-PMVs，并檢測了血小板活化指標(biāo)——GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，oxLDL-PMVs(30μg/mL)能夠顯著增加CD36陽性血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌(P＜0.05);阻斷血小板膜CD36后，血小板活化指標(biāo)均明顯降低（P＜0.05），但是相同條件下經(jīng)CD36中和抗體的同型對(duì)照IgG預(yù)處理卻不能抑制oxLDL-PMVs

56、對(duì)血小板的活化作用;采用AnnexinⅤ阻斷PMVs表面的PS同樣能夠抑制oxLDL-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化（P＜0.05）。同時(shí)，我們檢測了經(jīng)過上述各種處理后血小板表面CD36的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)中和CD36后血小板膜CD36表達(dá)有所降低，其它各組并無顯著變化。
　　 (5)OxLDL-PMVs誘導(dǎo)血小板的活化呈JNK信號(hào)通路依賴性
　　 為了明確JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路對(duì)oxLDL-PMVs誘導(dǎo)血小板的活化的潛在作用，我們用

57、JNK抑制劑SP600125預(yù)處理血小板后加入oxLDL-PMVs刺激。結(jié)果顯示，阻斷JNK信號(hào)通路能夠顯著抑制oxLDL-PMVs對(duì)血小板的激活作用，包括GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌（P＜0.05）;經(jīng)SP600125預(yù)處理后，血小板表面的CD36表達(dá)并無顯著變化。
　　 (6)OxLDL-PMVs能夠上調(diào)血小板JNK2及其上游MKK4的磷酸化水平
　　 對(duì)于CD36陽性血小板，oxLDL-P

58、MVs刺激能夠顯著促進(jìn)JNK2及其上游信號(hào)分子MKK4的磷酸化水平升高（P＜0.05）;當(dāng)oxLDL-PMVs(30μg/mL)分別作用0min、5min、15min、30min時(shí)，JNK2磷酸化水平呈時(shí)間依賴性提高;分別用不同濃度（0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL）oxLDL-PMVs作用于CD36陽性血小板30min，發(fā)現(xiàn)隨著oxLDL-PMVs濃度的升高，JNK2磷酸化水平呈劑量依賴性提高。但是對(duì)于CD

59、36陰性的血小板，oxLDL-PMVs刺激對(duì)MKK4/JNK2的磷酸化水平基本無影響。
　　 2.PMVs介導(dǎo)炎癥對(duì)血小板功能影響的研究
　　 (1)IL-6刺激能夠促進(jìn)PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs的釋放
　　 與對(duì)照組相比，IL-6能夠顯著促進(jìn)PMVs總量及AnnexinⅤ陽性的PMVs的生成，其作用可與血小板激活劑ADP相比(P＜0.05)。
　　 (2)IL-6依賴的PMVs(IL-6-

60、PMVs)對(duì)血小板活性的影響
　　 與對(duì)照組相比，IL-6-PMVs刺激組血小板PAC-1的MFI及陽性百分率均顯著增加（P＜0.05）;此外，IL-6-PMVs能夠明顯促進(jìn)ADP誘導(dǎo)下的血小板的聚集。
　　 (3)IL-6-PMVs誘導(dǎo)血小板的活化呈CD36、PS依賴性
　　 IL-6-PMVs(30μg/mL)與CD36陰性血小板(1×106/mL)在常溫下相互作用30min后，血小板PAC-1的MFI及陽性

61、百分率都未見明顯變化;ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率未見明顯增強(qiáng)。
　　 IL-6-PMVs能夠顯著增加CD36陽性血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌（P＜0.05）;阻斷血小板膜CD36后，血小板活化指標(biāo)均明顯降低(P＜0.05);采用AnnexinⅤ阻斷PMVs表面的PS同樣能夠抑制IL-6-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化(P＜0.05)。
　　 (4)MKK4/JNK2信號(hào)通路對(duì)IL-6-PMVs誘導(dǎo)

62、血小板活化的影響
　　 阻斷JNK信號(hào)通路能夠顯著抑制IL-6-PMVs對(duì)血小板的激活作用，包括GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌(P＜0.05)。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，對(duì)于CD36陽性血小板，IL-6-PMVs(30μg/mL)能夠顯著上調(diào)JNK2及其上游信號(hào)分子MKK4的磷酸化水平(P＜0.05);當(dāng)IL-6-PMVs(30μg/mL)作用0min、5min、15min、30mi

63、n，JNK2磷酸化水平呈時(shí)間依賴性提高;分別用不同濃度（0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL）IL-6-PMVs作用CD36陽性血小板30min，發(fā)現(xiàn)隨著IL-6-PMVs濃度的升高，JNK2磷酸化水平呈劑量依賴性提高。但是對(duì)于CD36陰性的血小板，IL-6-PMVs刺激對(duì)MKK4/JNK2的磷酸化水平基本無影響。
　　 (5)丹參酮ⅡA能夠抑制IL-6-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化
　　 為了驗(yàn)證血

64、小板PMV-CD36結(jié)合體及其介導(dǎo)的信號(hào)通路能否成為高水平炎癥狀態(tài)下血小板過度激活的干預(yù)靶點(diǎn)，我們進(jìn)一步探討其被藥物干預(yù)的可能性。在加入IL-6-PMVs(30μg/mL)刺激前給予血小板不同濃度的丹參酮ⅡA(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)預(yù)處理15min。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴性的抑制IL-6-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化:5μg/mL丹參酮ⅡA使血小板PAC-1百分率降

65、低，但效果不顯著;10μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)血小板活化指標(biāo)的抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板活化的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，我們檢測了丹參酮ⅡA對(duì)血小板膜CD36表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴性的抑制血小板CD36的表達(dá);當(dāng)?shù)⑼駻濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，其抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板CD36表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。W

66、esternblot結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA能夠有效下調(diào)IL-6-PMVs誘導(dǎo)的JNK2及其上游信號(hào)分子MKK4磷酸化水平(P＜0.05)。
　　 3.PMVs介導(dǎo)AGEs對(duì)血小板功能影響的研究
　　 (1)AGEs刺激能夠促進(jìn)PMVs及AnnexinⅤ陽性的PMVs的釋放
　　 AGEs（200μg/mL）及ADP(10μmol/mL)刺激組M門內(nèi)的PMVs數(shù)量顯著增多，BSA(200μg/mL)刺激組較對(duì)照組未見

67、明顯變化。定量分析流式細(xì)胞術(shù)和ELISA的結(jié)果顯示:與對(duì)照組及BSA處理組相比，AGEs能夠顯著促進(jìn)PMVs總量及AnnexinⅤ陽性的PMVs的生成(P＜0.05)，其作用可與血小板激活劑ADP相比。
　　 (2)AGEs依賴的PMVs(AGE-PMVs)對(duì)血小板活性的影響
　　 與對(duì)照組相比，AGE-PMVs刺激組及ADP刺激組的血小板被明顯活化，表現(xiàn)為GPⅡb/Ⅲa的MFI及陽性百分率均明顯升高(P＜0.05);此

68、外，AGE-PMVs能夠顯著增強(qiáng)ADP誘導(dǎo)的血小板的聚集。
　　 (3)AGE-PMVs誘導(dǎo)血小板的活化呈CD36、PS依賴性
　　 AGE-PMVs(30μg/mL)與CD36陰性血小板(1×106/mL)在常溫下相互作用30min后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，血小板PAC-1的MFI及陽性百分率都未見明顯變化;ADP誘導(dǎo)的血小板聚集率未見明顯增強(qiáng)。
　　 AGE-PMVs能夠顯著增加CD36陽性的血小板GPⅡb/Ⅲ

69、a的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌(P＜0.05);阻斷血小板膜CD36后，血小板活化指標(biāo)均明顯降低(P＜0.05);采用AnnexinⅤ阻斷PMVs表面的PS同樣能夠抑制AGE-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化(P＜0.05)。
　　 (4)MKK4/JNK2信號(hào)通路對(duì)AGE-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化的影響
　　 阻斷JNK信號(hào)通路能夠顯著抑制AGE-PMVs對(duì)血小板的激活作用，包括GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-se

70、lectin的分泌（P＜0.05）。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，對(duì)于CD36陽性血小板，AGE-PMVs（30μg/mL）能夠顯著上調(diào)JNK2及其上游信號(hào)分子MKK4的磷酸化水平(P＜0.05);當(dāng)AGE-PMVs（30μg/mL）分別作用0min、5min、15min、30min時(shí)，JNK2磷酸化水平呈時(shí)間依賴性提高，15min達(dá)到峰值水平;分別用不同濃度(0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/m

71、L)AGE-PMVs作用CD36陽性血小板30min，發(fā)現(xiàn)隨著AGE-PMVs濃度的升高，JNK2磷酸化水平呈劑量依賴性提高。但是對(duì)于CD36陰性的血小板，AGE-PMVs刺激對(duì)MKK4/JNK2的磷酸化水平基本無影響。
　　 (5)丹參酮ⅡA能夠抑制AGE-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化
　　 在加入AGE-PMVs（30μg/mL）刺激前，用不同濃度的丹參酮ⅡA(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL

72、、100μg/mL)預(yù)處理洗滌血小板15min，然后檢測血小板活化指標(biāo)GPⅡb/Ⅲa。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴性的抑制AGE-PMVs誘導(dǎo)的血小板活化;當(dāng)?shù)⑼駻濃度達(dá)到10μg/mL時(shí)，其對(duì)血小板活化的抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板活化的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，我們檢測了丹參酮ⅡA對(duì)血小板膜CD36表達(dá)的影響。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示:丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴

73、性的抑制血小板CD36的表達(dá);當(dāng)?shù)⑼駻濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，其抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板CD36表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。Westernblot結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA和SP600125（JNK抑制劑，陽性對(duì)照）均能夠顯著下調(diào)AGE-PMVs誘導(dǎo)的JNK2磷酸化水平升高（P＜0.05）;丹參酮ⅡA還能夠有效抑制AGE-PMVs誘導(dǎo)的MKK4的磷酸化水平（P＜0.05）。
　　

74、 結(jié)論：
　　 (1)OxLDL、IL-6及AGEs刺激均能夠促進(jìn)PMVs的釋放;
　　 (2)各種刺激來源的PMVs均能夠促進(jìn)CD36陽性的血小板活化，但對(duì)CD36陰性的血小板幾乎無影響;
　　 (3)各種刺激來源的PMVs對(duì)血小板的活化作用呈CD36、PS依賴性;
　　 (4)MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與各種刺激來源的PMVs對(duì)血小板的激活;
　　 (5)丹參酮ⅡA能夠抑制各種刺激來源的

75、PMVs對(duì)血小板的激活;
　　 (6)丹參酮ⅡA對(duì)PMVs作用的抑制是通過對(duì)CD36/MKK4/JNK2信號(hào)通路的抑制而發(fā)揮作用的，提示PMV-CD36及其介導(dǎo)的信號(hào)通路可以作為高氧化應(yīng)激、高炎癥及AGEs刺激條件下防治血小板過度激活的有效靶點(diǎn)。
　　 論文Ⅲ
　　 房顫病人來源的microvesicles與血小板活化關(guān)系的研究
　　 研究背景：
　　 非瓣膜性心房顫動(dòng)（房顫）是最常見的快速性心律

76、失常，導(dǎo)致房顫患者致死、致殘的最主要原因是血栓栓塞所致的腦卒中。血小板活化在血栓形成中起著非常重要的作用。腦卒中高危的非瓣膜性房顫患者血小板活化水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中低?；颊?。但是，非瓣膜性房顫中血小板被激活的機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明。
　　 藥物維持竇性心律和控制心室率的循證醫(yī)學(xué)（AFFIRM、RACE及AF/CHF）結(jié)果表明，“節(jié)律”控制治療并不優(yōu)于“心率”控制治療，2種方法在卒中發(fā)生率方面并無顯著性差異。這提示我們，房顫時(shí)血栓前

77、狀態(tài)及血栓的形成并不完全依賴于房顫本身，推測可能是與房顫伴隨的基礎(chǔ)病因有關(guān)。非瓣膜性房顫的上游疾病如冠心病、高血壓、糖尿病、老齡化等使房顫患者處于較高的炎癥、氧化應(yīng)激及AGEs水平。腦卒中高危的非瓣膜性房顫患者血漿中的氧化應(yīng)激、炎癥指標(biāo)及AGEs遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中低?；颊?。越來越多的研究表明，炎癥、氧化應(yīng)激及AGEs參與了非瓣膜性房顫高凝狀態(tài)的形成。上述研究分別提供了各自獨(dú)立的證據(jù)，卻無法將這些導(dǎo)致高凝狀態(tài)的各種機(jī)制作為一個(gè)整體進(jìn)行系統(tǒng)性研究，

78、使治療缺乏特異性。因此，尋找一種能夠同時(shí)承載上述啟動(dòng)血小板活化的各種機(jī)制的載體，以此為工具深入研究房顫時(shí)血栓前狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制，將為探索房顫時(shí)高凝狀態(tài)綜合防治的新的有效靶點(diǎn)提供依據(jù)。
　　 Microvesicles(MVs)能夠作為介導(dǎo)氧化應(yīng)激、炎癥或聚積的AGEs活化血小板的重要載體。炎癥、氧化應(yīng)激及聚積的AGEs是房顫發(fā)生、心房纖維化及血栓前狀態(tài)形成的重要機(jī)制已被眾多學(xué)者肯定。我們有理由推測，房顫患者循環(huán)中的microves

79、icles是氧化應(yīng)激、炎癥及AGEs綜合作用的產(chǎn)物，同時(shí)攜帶血小板活化的各種信息，是深入研究房顫時(shí)血栓前狀態(tài)的發(fā)生機(jī)制的重要載體。我們?cè)谡撐蘑蛑凶C實(shí)，在氧化應(yīng)激、炎癥或AGEs條件下，MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)了PMVs與血小板膜CD36結(jié)合后激活血小板的過程，但是這條通路是否介導(dǎo)了房顫條件下microvesicles激活血小板的過程未見報(bào)道。
　　 掘此，我們提出如下假說:非瓣膜性房顫狀態(tài)下，microvesicles

80、是綜合諸多基礎(chǔ)病因（氧化應(yīng)激、炎癥及聚集的AGEs等）的重要載體，通過與血小板膜CD36結(jié)合，啟動(dòng)了MV-CD36結(jié)合體介導(dǎo)MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化血小板，隨之分泌更多Annexin-Ⅴ陽性的MVs，進(jìn)一步與更多的血小板CD36結(jié)合，通過正反饋機(jī)制，大量活化血小板，啟動(dòng)房顫的血栓前狀態(tài)或高凝狀態(tài)，進(jìn)而導(dǎo)致血栓形成及血栓栓塞事件。
　　 研究目的：
　　 1.非瓣膜性房顫環(huán)境中microvesicles對(duì)血小板活

81、化的作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制;
　　 2.MV-CD36結(jié)合體及其介導(dǎo)的信號(hào)通路作為血栓前狀態(tài)綜合防治的新的有效靶點(diǎn)的可能性。
　　 方法：
　　 1.正常人血小板的分離:健康獻(xiàn)血志愿者未服用過任何抗血小板藥物，隔夜禁食12～14小時(shí)，次日清晨在輕扎壓脈帶或不扎壓脈帶的情況下，抽取空腹肘靜脈血20mL于0.109mol/L枸櫞酸鈉抗凝(1∶9)的塑料采血管中。常溫下，抗凝血靜置10min后，經(jīng)過120g離心10分鐘后獲

82、得富含血小板血漿(PRP)，后者加入100nmol/LPG-E1后經(jīng)800g離心后得到血小板沉淀。血小板沉淀經(jīng)改良臺(tái)式液(137mmol/LNaCl，2.7mmol/LKCl，12mmol/LNaHCO3，0.4mmol/LNaH2PO4,5mmol/LHEPES,0.1％Glucose,0.35％BSA,100nmol/LPG-E1,pH7.2)洗滌、重懸。血小板懸液的濃度經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀調(diào)整為1×106/mL，且立即應(yīng)用于各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。

83、r>　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測非瓣膜性房顫病人乏血小板血漿(PFP)中MVs的含量及性質(zhì):取100μL腦卒中高危房顫患者（CHADS2評(píng)分≥2）的PFP與10μL小鼠抗人PE-cyTM5-CD41a,10μLFITC-AnnexinⅤ,100μL緩沖液(10mMHepes/NaOH,140mMNaCl，2.5mMCaCl2，PH7.4)于BD流式管內(nèi)輕輕混勻，室溫下避光孵育15min后，即刻上機(jī)分析。
　　 3.高速梯度離心法分

84、離房顫患者血漿中的MVs:根據(jù)CHADS2評(píng)分選取非瓣膜性房顫腦卒中高?；颊呒澳挲g、性別相匹配的中低?；颊?，抽取3.8％枸櫞酸鈉抗凝空腹靜脈血，經(jīng)3，000g離心20分鐘后，得PFP。PFP中加入PMSF后，于4℃條件下15，000g高速離心60min，將獲得的MVs沉淀經(jīng)過兩次充分洗滌后-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　 4.雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜蛋白CD36的表達(dá):在BD流式管內(nèi)加入血小板懸液（2.5μL）與5μL小鼠抗人PEcy

85、5-CD41a，5μL小鼠抗人PE-CD36或其同型對(duì)照小鼠抗人PE-IgM，輕輕混勻，在室溫下避光孵育15min后，用1mLPBS重懸細(xì)胞，即刻上機(jī)分析。
　　 5.流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜糖蛋白(GP)Ⅱb/Ⅲa:洗滌血小板懸液(1×106/mL)與MVs(30μg/mL)在常溫下孵育30min。于BD流式管內(nèi)加入處理后的血小板懸液(2.5μL)與5μL小鼠抗人PEcy5-CD41a，5μL小鼠抗人FITC-PAC-1（能夠識(shí)

86、別與結(jié)合因血小板激活而異構(gòu)的GPⅡb/Ⅲa）輕輕混勻后，室溫下避光孵育15min后，用1mLPBS重懸細(xì)胞，即刻上機(jī)分析。
　　 6.雙色流式細(xì)胞術(shù)檢測血小板膜CD40L的表達(dá):洗滌血小板懸液(1×106/mL)與MVs(30μg/mL)在常溫下孵育30min。于BD流式管內(nèi)加入處理后的血小板懸液（2.5μL）與5μL小鼠抗人PEcy5-CD41a，5μL小鼠抗人PE-CD40L，輕輕混勻后，室溫下避光孵育15min后，用1mL

87、PBS重懸細(xì)胞，即刻上機(jī)分析。
　　 7.酶聯(lián)免疫法測定細(xì)胞上清中可溶性P-selectin含量:將MVs(30μg/mL)與洗滌血小板懸液(1×106/mL)于常溫下孵育刺激30min后，MV-血小板混合液3，000g離心10min后取上清，后者再次12，000g離心3min避免血小板的干擾。ELISA法檢測最終細(xì)胞上清液中可溶性P-selectin含量，操作方法及步驟嚴(yán)格按照說明書的要求進(jìn)行。
　　 8.Wester

88、nblot檢測:裂解經(jīng)MVs刺激的血小板懸液(1×106/mL)，提取蛋白，westernblot檢測CD36陽性或CD36陰性的血小板內(nèi)磷酸化及非磷酸化的MKK4和JNK的表達(dá)量。具體實(shí)驗(yàn)步驟同論文Ⅱ。
　　 9.丹參酮ⅡA對(duì)MVs活化血小板的干預(yù)試驗(yàn):在加入MVs(30μg/mL)刺激前，給予洗滌血小板(1×106/mL)不同濃度的丹參酮ⅡA(5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL)預(yù)

89、處理15min，然后采用流式細(xì)胞術(shù)檢測處理后的血小板表面GPⅡb/Ⅲa及CD36的表達(dá);采用westernblot的方法檢測MKK4/JNK信號(hào)分子的磷酸化水平。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)房顫病人來源的MVs對(duì)血小板活性的影響
　　 我們采用高速離心的方法從非瓣膜性房顫腦卒中高?；颊叻ρ“逖獫{中分離出MVs(AF-MVs)，同時(shí)從年齡、性別均與高?；颊咂ヅ涞姆前昴ば苑款澞X卒中低?；颊叻ρ“逖獫{中分離出M

90、Vs作為對(duì)照(C-MVs)。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AF-MVs大多為CD41a陽性、AnnexinⅤ陽性，即大部分MVs來源于血小板，且具有很強(qiáng)的促凝活性。
　　 與對(duì)照組及C-MVs刺激組相比，AF-PMVs刺激組血小板PAC-1的平均熒光強(qiáng)度(MFI)及陽性百分率均顯著增加(P＜0.05);此外，AF-MVs能夠明顯促進(jìn)血小板表面CD40L的表達(dá)（P＜0.05）;與對(duì)照組相比，C-MVs作用后的血小板PAC-1的MFI及百

91、分率，血小板CD40L表達(dá)一定程度上有所增加，但強(qiáng)度較弱。
　　 (2)AF-MVs誘導(dǎo)血小板的活化呈CD36、PS依賴性
　　 AF-MVs(30μg/mL)和C-MVs(30μg/mL)分別與CD36陰性血小板(1×106/mL)在常溫下相互作用30min后，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，血小板PAC-1的MFI及陽性百分率都未見明顯變化;此外，血小板表面CD40L的表達(dá)未見明顯增強(qiáng)。
　　 AF-MVs能夠顯著增加C

92、D36陽性血小板GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)及可溶性P-selectin的分泌(P＜0.05);阻斷血小板膜CD36后，血小板活化指標(biāo)均明顯降低（P＜0.05）;采用AnnexinⅤ阻斷PMVs表面的PS同樣能夠抑制AF-MVs誘導(dǎo)的血小板活化（P＜0.05）。
　　 (3)MKK4/JNK2信號(hào)通路對(duì)AF-MVs誘導(dǎo)的血小板活化的影響
　　 阻斷JNK信號(hào)通路能夠顯著抑制AF-MVs對(duì)血小板的激活作用，包括GPⅡb/Ⅲa的表達(dá)

93、及可溶性P-selectin的分泌（P＜0.05）。
　　 Westernblot結(jié)果顯示，AF-MVs(30μg/mL)能夠顯著上調(diào)CD36陽性血小板JNK2及其上游信號(hào)分子MKK4的磷酸化水平(P＜0.05);在AF-MVs（30μg/mL）作用0min、5min、15min、30min，JNK2磷酸化水平呈時(shí)間依賴性提高，15min達(dá)到峰值水平;分別用不同濃度（0μg/mL、10μg/mL、30μg/mL、50μg/mL)

94、IL-6-PMVs作用CD36陽性血小板30min，發(fā)現(xiàn)隨著AF-MVs濃度的升高，JNK2磷酸化水平呈劑量依賴性提高。但是對(duì)于CD36陰性的血小板，AF-MVs刺激對(duì)MKK4/JNK2的磷酸化水平基本無影響。
　　 (4)丹參酮ⅡA干預(yù)對(duì)AF-MVs誘導(dǎo)的血小板活化的影響
　　 為了驗(yàn)證血小板MV-CD36結(jié)合體及其介導(dǎo)的信號(hào)通路能否成為房顫時(shí)高凝狀態(tài)綜合防治的有效靶點(diǎn)，我們進(jìn)一步探討其被藥物干預(yù)的可能性。我們分別用不

95、同濃度的丹參酮ⅡA（5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、50μg/mL、100μg/mL）預(yù)處理血小板15min后加入AF-MVs(30μg/mL)刺激。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴性的抑制AF-MVs誘導(dǎo)的血小板活化:5μg/mL丹參酮ⅡA使血小板PAC-1百分率降低，但效果不顯著;10μg/mL丹參酮ⅡA對(duì)血小板活化指標(biāo)的抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板活化的抑制作用

96、也逐漸增強(qiáng)。同時(shí)，我們檢測了丹參酮ⅡA對(duì)血小板膜CD36表達(dá)的影響。結(jié)果顯示:丹參酮ⅡA在體外能夠呈劑量依賴性的抑制血小板CD36的表達(dá);當(dāng)?shù)⑼駻濃度達(dá)到20μg/mL時(shí)，其抑制作用達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;隨著丹參酮ⅡA濃度的增加，其對(duì)血小板CD36表達(dá)的抑制作用也逐漸增強(qiáng)。Westernblot結(jié)果顯示，丹參酮ⅡA還能夠抑制AF-MVs誘導(dǎo)的JNK2及其的上游信號(hào)分子MKK4的磷酸化水平。
　　 結(jié)論：
　　

97、 (1)非瓣膜性房顫病人循環(huán)中的MVs大部分來源于血小板，且具有很強(qiáng)的促凝活性;
　　 (2)AF-MVs能夠促進(jìn)CD36陽性的血小板活化，但對(duì)CD36陰性的血小板無效;
　　 (3)AF-MVs對(duì)血小板的活化作用呈CD36、PS依賴性;
　　 (4)MKK4/JNK2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與AF-MVs對(duì)血小板的激活;
　　 (5)丹參酮ⅡA能夠抑制AF-MVs對(duì)血小板的激活;
　　 (6)丹參酮ⅡA