檸檬苦素類化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性及作用機(jī)制.pdf

1、檸檬苦素類化合物是一系列含呋喃環(huán)的高度氧化的四環(huán)三萜類化合物，主要存在于蕓香科（Rutaceae）和楝科（Meliaceae）植物中，其味苦，具有抗腫瘤、抗病毒、廣譜抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜催眠、抗瘧原蟲等生物藥物活性。楝科植物木果楝(Xylocarpusgranatum)為一種生長(zhǎng)在熱帶沿海地帶的紅樹林植物，海南民間用其種皮治療赤痢，種仁用作滋補(bǔ)品，在東南亞國(guó)家民間用其治療腹瀉、霍亂和由瘧疾引起的發(fā)熱，還可用作昆蟲拒食劑。本研究首次檢測(cè)

2、了從木果楝種子中純化的八種檸檬苦素類化合物抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖的效應(yīng)，并進(jìn)一步選取與細(xì)胞凋亡相關(guān)的蛋白p53和Bax為研究對(duì)象，探討了檸檬苦素類化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。為開發(fā)新的抗腫瘤細(xì)胞增殖活性強(qiáng)，并且毒副作用低的抗腫瘤藥物奠定基礎(chǔ)。
　　第一部分八種檸檬苦素類化合物對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞增殖活性的抑制作用
　　目的：觀察8種檸檬苦素類化合物XylocarpinH(1)、XylogranatinC(2)、Xylomexi

3、caninA(3)、xylogranatinD(4)、7-Deacetyl-7-oxogedunin(5)、XyloccensinK(6)、xylocarponoidA(7)和Odoratone(8)對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，以篩選出具有明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖活性的化合物。
　　方法：采用4-甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)細(xì)胞增殖。將人肺腫瘤細(xì)胞接種于96孔板，每孔含1×104個(gè)細(xì)胞，分別加入溶劑對(duì)照（終濃度為0.1％DMSO）、

4、陽性對(duì)照順鉑和終濃度分別為100μmol/L或以100μmol/L為起始濃度，倍比稀釋8個(gè)濃度梯度的八種檸檬苦素類化合物，每組設(shè)3復(fù)孔，置于飽和濕度、37℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。于培養(yǎng)結(jié)束前4h，加入5mg/mLMTT。實(shí)驗(yàn)終止測(cè)定各孔吸光度值（OD值），用Origin7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以均數(shù)?標(biāo)準(zhǔn)差（x?s）表示，實(shí)驗(yàn)用化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞的濃度-效應(yīng)曲線用Hill數(shù)學(xué)模型擬合，計(jì)算藥物的IC50值。
　　結(jié)果：

5、（1）100μmol/L順鉑處理三種人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞：A549、RERF-LC-kj和QG-56后，顯示較強(qiáng)的抑制人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖的活性，細(xì)胞生存率分別為28.98%、44.66%和39.54%；用終濃度為100μmol/L的八種檸檬苦素類化合物1~8處理三種實(shí)驗(yàn)用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，化合物2、4、5、7、8顯示與順鉑相同或強(qiáng)于順鉑的抑制A549、RERF-LC-kj和QG-56細(xì)胞系增殖的作用；（2）100μmol/L順鉑和

6、八種檸檬苦素類化合物1~8處理人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（QG-90和PC-6細(xì)胞）后，化合物2、4、5、7、8顯示強(qiáng)于順鉑的抑制QG-90和PC-6細(xì)胞增殖活性；（3）通過腫瘤細(xì)胞增殖生存率對(duì)XylogranatinC(2)濃度的對(duì)數(shù)回歸方程，得到XylogranatinC(2)對(duì)A549、RERF-LC-kj、QG-56、QG-90和PC-6細(xì)胞增殖的半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為4.79μmol/L，12.07μmol/L，23.22μmo

7、l/L，4.40μmol/L和4.57μmol/L。
　　結(jié)論：XylogranatinC可明顯抑制人肺腫瘤細(xì)胞增殖，并呈現(xiàn)劑量依賴性，對(duì)于9,10-開裂的墨西哥交酯型且C-30位上羥基氫的取代基較小的檸檬苦素顯示較強(qiáng)的抑制肺腫瘤活性。
　　第二部分檸檬苦素類化合物XylogranatinC對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制研究
　　目的：以往大量實(shí)驗(yàn)已證明，許多抗癌藥物均可誘導(dǎo)不同類型的腫瘤細(xì)胞凋亡，多種中草藥提取的單

8、體化合物是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而發(fā)揮抗腫瘤作用。第一部分實(shí)驗(yàn)證實(shí)了檸檬苦素類化合物對(duì)人肺腫瘤細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。本部分實(shí)驗(yàn)將利用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)檸檬苦素類化合物XylogranatinC是否能誘導(dǎo)人肺腫瘤細(xì)胞凋亡，Westernblot觀察凋亡相關(guān)蛋白p53、Bax和caspase-3的表達(dá)變化，以探討檸檬苦素類化合物XylogranatinC的抗腫瘤作用機(jī)制。
　　方法：（1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：終濃度為10μmo

9、l/L的檸檬苦素類化合物XylogranatinC孵育細(xì)胞24h，收集細(xì)胞。用PBS洗滌3次，胰蛋白酶消化，用70%的乙醇固定；加入10%雞紅細(xì)胞作為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，與樣品同步染色，加入碘化丙啶一步插入DNA熒光染色（PropidiumIodide,PI:50mg/L，triton-x1001.0%），在4℃冰箱避光染色30min，以500目銅網(wǎng)過濾，使樣品成為合格的單細(xì)胞懸液，并調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×105~5×106/L。采用美國(guó)Beckma

10、nCoulter公司生產(chǎn)的Epics-XLⅡ型流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA檢測(cè)。（2）Westernblot檢測(cè)p53、Bax及Caspase-3的變化：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按2×106個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)皿接種A549細(xì)胞。加入終濃度為10?mol/L的陽性對(duì)照順鉑和XylogranatinC的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞48h，離心收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入上樣緩沖液100?L，劇烈震蕩后冰浴下超聲波處理1min。100℃加熱3min使蛋白質(zhì)變性，1500

11、0r/min離心15min，取上清液測(cè)定蛋白濃度。取50?g蛋白在SDS-PAGE電泳下分離，分離膠為12%，濃縮膠為5%。根據(jù)預(yù)染的蛋白Marker指示，小心割取GR所在的區(qū)帶，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜，用5%脫脂奶粉于室溫下?lián)u動(dòng)封閉膜1h。膜在抗Caspase-3多克隆抗體(1:800)、抗Bax多克隆抗體(1:1000)、抗p53多克隆抗體（1:1000）和β-actin(1:1000)稀釋液中室溫過夜，1×TBS-T洗膜15min，共

12、3次后，在二抗稀釋液(抗鼠1:20000)中避光孵育20min。再次洗膜后加入ECL試劑，反應(yīng)5min，用X片曝光1~10min后，顯影?；瘜W(xué)發(fā)光法顯色。用Imagej圖像分析軟件對(duì)其進(jìn)行半定量分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），用最小顯著差法（leastsignificantdifference,LSD）作兩兩比較，P<0.05為有顯著性差異。
　　結(jié)果：（1）Xylograna

13、tinC對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響：10μmol/L的XylogranatinC處理A549細(xì)胞24h后，A549細(xì)胞早期凋亡率為(31.7±2.6)%，與空白對(duì)照組(5.4±0.4)%比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，提示XylogranatinC促進(jìn)了A549細(xì)胞的凋亡。（2）XylogranatinC對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)p53蛋白、Bax蛋白和caspase-3蛋白的上調(diào)作用：10μmol/L的順鉑和XylogranatinC作

14、用A549細(xì)胞后，均可明顯上調(diào)細(xì)胞內(nèi)的p53、Bax和caspase-3表達(dá)。（3）半胱天冬酶抑制劑對(duì)XylogranatinC抑制A549細(xì)胞增殖的翻轉(zhuǎn)作用：使用1、10和100μmol/L的順鉑和XylogranatinC處理A549細(xì)胞，其細(xì)胞生存率分別為83.66%、56.27%、28.98%和59.87%、24.31%、2.76%；使用20μmol/L的半胱天冬酶抑制劑與順鉑和XylogranatinC共同孵育A549細(xì)胞后，

15、其細(xì)胞生存率分別上升為97.77%、74.90%、56.34%和82.78%、46.27%、10.98%。
　　結(jié)論：檸檬苦素類化合物XylogranatinC可明顯誘導(dǎo)人肺腫瘤細(xì)胞A549細(xì)胞凋亡；XylogranatinC可上調(diào)A549細(xì)胞p53表達(dá)，上調(diào)Bax表達(dá),上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，這可能是檸檬苦素類化合物XylogranatinC引起A549細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。而且實(shí)驗(yàn)也證明了半胱天冬酶抑制劑能夠翻轉(zhuǎn)由Xyl