白花前胡素類化合物抗炎活性以及分子作用機(jī)制的研究.pdf

1、炎癥本質(zhì)是機(jī)體應(yīng)對(duì)各種損傷性刺激實(shí)現(xiàn)自我保護(hù)的復(fù)雜防御反應(yīng)，眾多種類的細(xì)胞以及活性成分參與了這個(gè)過程。在炎癥初期，多種炎癥因子經(jīng)炎性細(xì)胞釋放后，對(duì)損傷因子進(jìn)行稀釋、殺傷以及清除，同時(shí)，炎癥因子也參與了機(jī)體受損部位的組織再生，促進(jìn)傷口的修復(fù)和愈合。然而，炎癥反應(yīng)一旦過于劇烈或持久，則會(huì)因?yàn)檠装Y因子本身所具有的機(jī)體破壞性而對(duì)正常組織和細(xì)胞造成損傷，誘發(fā)各種炎癥疾病。因此，炎癥就像機(jī)體的一把雙刃劍，適當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)會(huì)幫助機(jī)體清除損傷，抵御外來感

2、染，促進(jìn)傷口愈合;而過度的炎癥反應(yīng)則會(huì)反過來促使多種炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展，影響人們的健康。
　　 急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種典型的過度性炎癥參與的呼吸系統(tǒng)危重癥，其定義是:心源性以外的各種肺內(nèi)外致病因素引起的急性，進(jìn)行性缺氧性呼吸衰竭，是肺部炎癥和通透性增加的綜合征。多種臨床疾病均可誘發(fā)急性肺損傷，如肺炎、膿毒血癥、以及胰腺炎等。研究認(rèn)為，肺內(nèi)過度性、失控性炎癥反應(yīng)是各種病因所致ALI的根本原

3、因。
　　 目前，臨床上初步使用的ALI治療藥物主要有血管舒張劑（一氧化氮、前列環(huán)素的吸入治療）、糖皮質(zhì)激素、抗凝劑人類重組體活化蛋白C(activated proteinC，APC)、酮康唑(ketoconazole)、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)等。然而，這些藥物的療效在各臨床試驗(yàn)中還未完全得到證實(shí)，其用法用量還有著較大爭議，并且有著許多嚴(yán)重的不良反應(yīng)。因此，迄今為止，治療ALI藥物的總體研究進(jìn)展是令人較為失望的，臨床

4、期待更為安全有效的治療藥物。
　　 中藥前胡為傘形科植物白花前胡(Peucedanum praeruptorum Dunn)的干燥根，具有散風(fēng)清熱、降氣化痰等功效，臨床常用于風(fēng)熱咳嗽痰多、痰熱喘滿、咯痰黃稠等。前期的研究顯示白花前胡總提取物能夠明顯抑制二甲苯所致的小鼠耳腫脹和蛋清所致的大鼠足腫脹。同時(shí)，白花前胡提取物對(duì)卵蛋白(OVA)誘導(dǎo)的小鼠氣道變態(tài)炎癥反應(yīng)也有明顯的保護(hù)作用，這表明白花前胡良好的體內(nèi)抗炎活性。然而，這些工作的

5、主要研究對(duì)象是白花前胡粗提取物，并沒有涉及白花前胡素單體化合物，同時(shí)，其抗炎作用機(jī)制也沒有進(jìn)行探討。研究顯示，白花前胡的主要有效成分為白花前胡素(Praeruptorin)等香豆素類化合物，如白花前胡甲素(Praeruptorin A，PA)、白花前胡乙素(Praeruptorin B，PB)、白花前胡丙素(Praeruptorin C，PC)、白花前胡丁素(Praeruptorin D，PD)以及白花前胡E素（Praeruptorin

6、E，PE）。因此，在本研究中，我們研究了白花前胡素單體化合物（包括白花前胡甲素、丙素、丁素以及E素）的抗炎活性。我們利用脂多糖(LPS)建立體外巨噬細(xì)胞炎癥模型，在細(xì)胞和分子水平上，從炎癥相關(guān)因子NO、iNOS、TNF-α、IL-6的表達(dá)以及炎癥信號(hào)通路NF-κB、MAPK和STAT的活化來研究白花前胡素類化合物的抗炎活性以及相關(guān)作用機(jī)制。由于白花前胡在臨床上的應(yīng)用主要是針對(duì)肺部疾病的治療，因此，我們建立了LPS或者HCl誘導(dǎo)的急性肺損

7、傷小鼠模型，檢測白花前胡素類化合物對(duì)模型小鼠肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞浸潤、蛋白滲出以及炎癥細(xì)胞因子釋放的影響，同時(shí)，我們對(duì)小鼠肺組織中MPO的活力以及NF-κB通路的活化進(jìn)行探討，旨在研究和闡明白花前胡素類化合物對(duì)急性肺損傷的保護(hù)作用以及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 研究方法和實(shí)驗(yàn)結(jié)果分為兩大部分:
　　 一、白花前胡丙素(PC)、白花前胡丁素(PD)以及白花前胡E素(PE)抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)
　　 1、白花

8、前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)劑量的選擇:小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞以1×104/孔的密度鋪于96孔板后過夜貼壁，待各白花前胡素以2、4、8、16、32μg/ml劑量刺激細(xì)胞24 h后，采用MTT法對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，PC、PD以及PE在2-16μg/ml劑量范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力沒有顯著影響（差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。因此本研究選取2-16μg/ml劑量范圍應(yīng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 2、白花前胡丙素(PC)

9、、丁素(PD)以及E素(PE)抑制巨噬細(xì)胞中炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生:待各白花前胡素以2、4、8、16μg/ml劑量與1μg/ml的LPS共同刺激細(xì)胞18 h后，用Griess法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液上清中NO的含量。結(jié)果顯示，PC、PD以及PE均可劑量依賴性地抑制NO的釋放，其IC50值分別為7.6、5.6和5.8μg/ml。
　　 3、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)抑制巨噬細(xì)胞中iNOS蛋白的表達(dá):提取細(xì)胞總蛋白后，采

10、用Western blot法檢測巨噬細(xì)胞中iNOS的含量。結(jié)果顯示，在正常情況下，巨噬細(xì)胞中基本無iNOS的表達(dá)，而在LPS的刺激下，iNOS的表達(dá)顯著增高。PC、PD以及PE在16μg/ml劑量下均可顯著抑制iNOS蛋白的高表達(dá)。
　　 4、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)抑制巨噬細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生:小鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞以2×105/孔的密度鋪于24孔板后過夜貼壁，PC、PD和PE以2、4

11、、8、16μg/ml劑量與1μg/ml的LPS共同刺激細(xì)胞18 h。用ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)各白花前胡素可顯著抑制細(xì)胞培養(yǎng)液上清中TNF-α和IL-6的含量。PC、PD以及PE抑制TNF-α的IC50值為40.7、17.3和18.5μg/ml，而對(duì)于IL-6，PC、PD以及PE的IC50值分別為11.9、4.9和5.1μg/ml。
　　 5、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)抑制iNOS、TNF-α和IL-6 mR

12、NA的表達(dá):待各白花前胡素以4、8、16μg/ml劑量與1μg/ml的LPS共同刺激細(xì)胞6h后，提取細(xì)胞總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，用Real-time PCR法檢測細(xì)胞中iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，在正常情況下，巨噬細(xì)胞中iNOS、TNF-α和IL-6 mRNA的表達(dá)均很少，而經(jīng)過LPS刺激之后，其表達(dá)量顯著增高。PC、PD以及PE均能劑量依賴性地抑制上述基因的表達(dá)。其中，在16μg/ml的劑量時(shí)，PC對(duì)iNOS、

13、TNF-α和IL-6 mRNA表達(dá)的抑制率分別為53％、35％和55％; PD的抑制率為75％、45％和72％;而PE的抑制率分別為78％、47％和70％。
　　 6、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)抑制巨噬細(xì)胞中NF-κB通路的激活
　　 a:PC、PD和PE抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB亞基p65的核轉(zhuǎn)運(yùn):提取細(xì)胞核蛋白，用Western blot法檢測細(xì)胞核蛋白中p65的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照細(xì)胞相比

14、，1μg/ml劑量的LPS明顯增加了巨噬細(xì)胞核蛋白中p65的含量;而各白花前胡素以16μg/ml劑量預(yù)處理細(xì)胞1h后，顯著抑制了LPS引起的胞核p65含量的增加，但并不影響核內(nèi)參蛋白lamin B的表達(dá)，說明白花前胡丙素、丁素以及E素可抑制NF-κB亞基p65由胞漿向胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。這一結(jié)果在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中也得到了證實(shí)。
　　 b:PC、PD和PE抑制LPS誘導(dǎo)的IκB蛋白降解:與對(duì)照組細(xì)胞相比，1μg/ml劑量的LPS刺激30

15、 min后明顯減少了巨噬細(xì)胞中IκB蛋白的含量;而白花前胡丙素、丁素以及E素以16μg/ml預(yù)處理細(xì)胞可顯著抑制IκB蛋白含量的減少。
　　 7、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)不能抑制巨噬細(xì)胞中MAPK通路的激活:MAPK是一類在各種組織細(xì)胞中廣泛存在的蛋白激酶，由p38、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)和C-Jun氨基末端激酶(JNK)三條信號(hào)通路組成。我們采用Westem blot方法研究PC、PD和P

16、E對(duì)MAPK通路的影響。結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，1μg/ml劑量的LPS顯著誘導(dǎo)了巨噬細(xì)胞中磷酸化p38(p-p38)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)以及磷酸化JNK（p-JNK）蛋白的增加。白花前胡丙素、丁素和E素(16μg/ml)對(duì)p-p38和p-JNK蛋白無明顯影響，但可誘導(dǎo)p-ERK1/2蛋白的增加。
　　 8、白花前胡丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)抑制脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中磷酸化STAT-3（p-S

17、TAT-3）蛋白的表達(dá)，但對(duì)磷酸化STAT-1（p-STAT-1）蛋白表達(dá)無影響:首先，我們用Western blot方法檢測LPS誘導(dǎo)的STAT-1和STAT-3蛋白磷酸化的時(shí)間依賴性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，STAT-1和STAT-3蛋白的磷酸化在LPS刺激2h后開始出現(xiàn)，并可至少持續(xù)至LPS刺激后6h。因此，我們選取中間時(shí)間4h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)。與對(duì)照細(xì)胞相比，單獨(dú)給藥的PC、PD和PE對(duì)p-STAT-1和p-STAT-3蛋白均無影響;而與

18、LPS組細(xì)胞相比，上述白花前胡素類化合物(16μg/ml)可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的p-STAT-3蛋白的增加，但對(duì)p-STAT-1蛋白無影響;陽性對(duì)照藥物，JAK-STAT通路抑制劑AG490，對(duì)LPS誘導(dǎo)的p-STAT-1和p-STAT-3蛋白均可抑制。說明PC、PD和PE對(duì)JAK-STAT通路中的STAT-3蛋白具有選擇性。
　　 二、白花前胡甲素(PA)、白花前胡丙素(PC)、白花前胡丁素(PD)以及白花前胡E素(PE)對(duì)急

19、性肺損傷小鼠模型的影響
　　 1、白花前胡甲素(PA)、丙素(PC)、丁素(PD)以及E素(PE)對(duì)LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型的影響:PA、PC、PD和PE以80 mg/kg劑量灌胃給藥，1h后，小鼠腹腔注射10％戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，待麻醉后滴鼻給予50μlLPS（40μg/ml）。小鼠在給予LPS四小時(shí)后處死，行肺部灌洗。以灌洗液為樣品，檢測其中的炎性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示，PD和PE對(duì)急性肺損傷小鼠

20、的細(xì)胞浸潤以及炎癥細(xì)胞因子釋放均有明顯的改善作用，而PA和PC幾乎無影響。
　　 a)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)劑量依賴性地減少肺損傷中炎性細(xì)胞的浸潤:對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)濃度為(15.0±3.90)×103/ml，而在LPS模型組，中性粒細(xì)胞濃度達(dá)到（648±45.8）×103/ml。80 mg/kg的PD和PE明顯抑制了中性粒細(xì)胞的浸潤，其濃度分別減少至(285±48.6)×103/ml和（3

21、81±56.4）×103/ml;
　　 b)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)劑量依賴性地抑制炎癥細(xì)胞因子的釋放:對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中的TNF-α和IL-6含量均很少，而LPS模型組中的細(xì)胞因子釋放顯著增多，TNF-α和IL-6的含量分別達(dá)到（6.645±0.70）和（1.096±0.149）ng/ml。80 mg/kg的PD和PE可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放。對(duì)于TNF-α，PD和PE兩組含量分別減少至（3.3

22、79±0.586）和(3.962±0.646)ng/ml;而對(duì)于IL-6，PD和PE兩組的含量分別降至(0.488±0.084)和（0.523±0.081）ng/ml。
　　 c)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)劑量依賴性地抑制肺泡灌洗液中總蛋白含量:用Bradford法檢測小鼠肺泡灌洗液中總蛋白的濃度，結(jié)果顯示PD和PE均可抑制灌洗液中蛋白含量的增加，說明PD和PE對(duì)LPS誘導(dǎo)的肺部蛋白滲出具有改善作用。
　　

23、 2、白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)抑制肺組織中MPO的活力:MPO活力反應(yīng)了中性粒細(xì)胞在組織的分布多少。我們分別檢測了PD和PE對(duì)肺組織中MPO活力的影響。結(jié)果顯示，PD可將LPS誘導(dǎo)的MPO活力從（0.802±0.057）U/g減少至（0.631±0.038）U/g;而PE則將模型組的（0.830±0.074）U/g抑制至（0.581±0.058）U/g。
　　 3、白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)抑

24、制LPS誘導(dǎo)的肺部病理變化:小鼠處死后，取肺葉固定、切片后進(jìn)行HE染色。光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡壁無水腫，肺實(shí)質(zhì)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤;LPS模型組小鼠肺泡壁則明顯水腫增厚，可見大量的肺間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤，有明顯的出血、水腫，顯示出嚴(yán)重的肺部炎癥和肺水腫現(xiàn)象。而PD和PE顯著減輕了LPS誘導(dǎo)的肺部損傷。
　　 4、白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)抑制LPS誘導(dǎo)的肺組織中NF-κB通路的活化:小

25、鼠處死后，取全肺用液氮研磨，分別提取肺組織中的胞漿和胞核蛋白，Western blot方法檢測胞漿中IκB蛋白和胞核中p65蛋白的含量。結(jié)果顯示，PD和PE均可抑制肺組織蛋白中IκB蛋白的降解，以及p65的核轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　 5、白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)對(duì)HCl誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠具有保護(hù)作用:PD和PE以80 mg/kg劑量灌胃給藥，1h后，小鼠腹腔注射10％戊巴比妥鈉(60 mg/kg)，待麻醉后滴鼻給予50μ

26、lHCl(0.1 mol/L)。小鼠在給予LPS四小時(shí)后處死，行肺部灌洗。以灌洗液為樣品，檢測其中的炎性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞因子的水平。結(jié)果顯示:
　　 a)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)顯著減少HCl誘導(dǎo)的肺部炎性細(xì)胞浸潤:對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細(xì)胞數(shù)濃度很低，而在HCl模型組，中性粒細(xì)胞顯著增加。80 mg/kg的PD和PE明顯抑制了中性粒細(xì)胞的浸潤，其抑制率分別為49.7％和40.0％。b)白花前胡丁素(PD)

27、和白花前胡E素(PE)顯著減少HCl誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6的釋放:對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中有少量IL-6表達(dá)，而HCl可顯著誘導(dǎo)IL-6的釋放。80 mg/kg的PD和PE明顯抑制了肺泡灌洗液中的IL-6含量，其抑制率分別為44.1％和39.6％。
　　 c)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)顯著減少HCl誘導(dǎo)的蛋白滲出:Bradford法檢測發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠肺泡灌洗液中有一定的蛋白含量，HCl可明顯誘導(dǎo)灌洗液中總蛋白的增加

28、，其含量約為對(duì)照組的3倍。80 mg/kg的PD和PE可明顯抑制蛋白滲出，其抑制率分別為29.2％和36.0％。
　　 d)白花前胡丁素(PD)和白花前胡E素(PE)抑制HCl誘導(dǎo)的肺部病理變化:同LPS誘導(dǎo)的肺損傷模型一樣，PD和PE也可明顯改善HCl誘導(dǎo)的肺部炎癥和水腫現(xiàn)象。
　　 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果和文獻(xiàn)分析，本文的結(jié)論如下:
　　 本研究建立LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型以及LPS/HCl誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷

29、模型，在細(xì)胞和動(dòng)物水平上對(duì)白花前胡素類化合物的抗炎活性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果顯示，白花前胡素類化合物，特別是白花前胡丁素(PD)以及白花前胡E素(PE)在體外以及體內(nèi)均具有良好的抗炎活性。這為白花前胡的臨床應(yīng)用及其現(xiàn)代藥理學(xué)研究提供了更多的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 1.白花前胡素類化合物通過抑制iNOS蛋白和mRNA的表達(dá)，從而抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生。同時(shí)，白花前胡素類化合物還可顯著減少炎癥細(xì)胞因子TNF-α和I

30、L-6的mRNA表達(dá)。這些結(jié)果顯示白花前胡素類化合物良好的體外抗炎活性。
　　 2.本論文研究了白花前胡素類化合物對(duì)三條主要炎癥信號(hào)通路的影響，發(fā)現(xiàn)該類化合物為NF-κB以及STAT-3的雙通路抑制劑，這合理解釋了白花前胡素類化合物的抗炎活性。另一方面，NF-kB以及STAT-3這兩條信號(hào)通路本身以及它們之間的cross-talk在眾多腫瘤疾病，特別是肝細(xì)胞癌的發(fā)生和發(fā)展中起到極為重要的作用，曾有不少研究報(bào)道了白花前胡素類化合物

31、抗腫瘤活性以及抗腫瘤耐藥的作用，本研究對(duì)白花前胡素類化合物的抗腫瘤作用的分子機(jī)制起到了一定的啟示作用。
　　 3.本研究的一大創(chuàng)新點(diǎn)在于首次報(bào)道了白花前胡丁素(PD)以及白花前胡E(PE)素對(duì)急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用。急性肺損傷是一種具有很高病死率的呼吸系統(tǒng)危重綜合癥，臨床尚無特別安全有效的治療藥物。本研究通過建立LPS和HCl誘導(dǎo)的兩種肺損傷模型，發(fā)現(xiàn)PD和PE可明顯改善肺損傷小鼠的中性粒細(xì)胞浸潤、細(xì)胞因子釋放以及蛋白滲出三大