Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)復(fù)合人牙髓前體細(xì)胞的神經(jīng)移植物生物學(xué)特性研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷因可能造成機(jī)體感覺和運(yùn)動(dòng)功能的部分或全部喪失，從而嚴(yán)重影響機(jī)體的功能行使和生活質(zhì)量，其修復(fù)再生一直備受關(guān)注。利用組織工程學(xué)的原理和方法制備人工神經(jīng)以修復(fù)周圍神經(jīng)缺損是這一研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。本課題正是基于此欲構(gòu)建一種新型的組織工程化神經(jīng)移植物并對其生物學(xué)性能進(jìn)行評價(jià)，為獲得可橋接周圍神經(jīng)缺損并可促進(jìn)周圍神經(jīng)再生以及功能恢復(fù)的生物性神經(jīng)移植物做一臨床前研究。
　　第一部分Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的制備與結(jié)構(gòu)觀察

2、
　　目的:制備一種新型脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架并對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)觀察。
　　方法:獲取新西蘭大白兔坐骨神經(jīng)后，分別利用經(jīng)典是Sondell化學(xué)法和新型Myroilysin酶對其進(jìn)行脫細(xì)胞處理，大體觀察并制作組織切片經(jīng)HE染色、Masson染色后光學(xué)顯微鏡下觀察脫細(xì)胞神經(jīng)支架的脫細(xì)胞效果、所保留神經(jīng)基底膜結(jié)構(gòu)以及膠原結(jié)構(gòu)，制作電鏡標(biāo)本通過掃描電鏡觀察不同方法制備的神經(jīng)支架的表面物理性狀。
　　結(jié)果:經(jīng)Sondell化學(xué)法處理的神

3、經(jīng)直徑基本無變化或稍小于天然神經(jīng)，但經(jīng)Myroilysin酶法處理的神經(jīng)有膨脹現(xiàn)象并且更為透明。組織學(xué)觀察，Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)獲得了與經(jīng)典Sondell化學(xué)法一致的結(jié)果，細(xì)胞、軸突、髓鞘結(jié)構(gòu)消失，神經(jīng)基底膜呈波浪狀，膠原纖維排列均勻有序。掃描電鏡結(jié)果顯示Myroilysin酶法比化學(xué)法獲得的神經(jīng)支架結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)更為明顯的縱形溝壑狀。
　　結(jié)論:Myroilysin酶法作為一種新型的脫細(xì)胞神經(jīng)支架制備方法，與sondell具

4、有類似的脫細(xì)胞效果，并且利用該方法制備的神經(jīng)支架同樣保留有均勻一致的基底膜結(jié)構(gòu)。但Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)支架更為明顯的縱形溝壑狀結(jié)構(gòu)可能對種子細(xì)胞的生長有“地形誘導(dǎo)”作用，是值得考慮的一種神經(jīng)支架材料。
　　第二部分人牙髓前體細(xì)胞的培養(yǎng)以及與神經(jīng)組織細(xì)胞相關(guān)的蛋白表達(dá)
　　目的:培養(yǎng)牙髓前體細(xì)胞并初步鑒定，探討其作為組織工程化神經(jīng)移植物種子細(xì)胞的可行性。
　　方法:獲取臨床就診的15-18歲患者中因正畸需要拔除

5、并且牙根尚未完全發(fā)育完成的第三恒磨牙牙髓組織。按照Gronthos酶消化法進(jìn)行原代培養(yǎng)，獲得牙髓細(xì)胞，并進(jìn)行傳代，對其第三代細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色，鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記STRO-1和周圍神經(jīng)雪旺細(xì)胞標(biāo)記S-100。
　　結(jié)果:獲得了能夠高度增殖的細(xì)胞，免疫熒光結(jié)果顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞中存在STRO-1陽性的細(xì)胞，同時(shí)也存在S-100陽性的細(xì)胞。
　　結(jié)論:本研究所獲得的細(xì)胞中存在牙髓前體細(xì)胞，并且存在與某些神經(jīng)細(xì)胞功能相似的細(xì)胞，

6、將S-100陽性的牙髓前體細(xì)胞作為周圍神經(jīng)組織工程的種子細(xì)胞以獲得更具神經(jīng)營養(yǎng)功能的神經(jīng)移植物具有一定的可行性。
　　第三部分Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的生物學(xué)性能
　　目的:評價(jià)Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的生物學(xué)性能，探討牙髓前體細(xì)胞與該神經(jīng)支架的生物適合性，為將來構(gòu)建用于臨床使用的新型人工神經(jīng)提供理論依據(jù)。
　　方法:制備脫細(xì)胞神經(jīng)支架浸提液，與牙髓前體細(xì)胞共培養(yǎng)，通過CCK-8細(xì)胞增殖試驗(yàn)

7、評價(jià)該支架的細(xì)胞相容性;將脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架植入Wistar大鼠皮下，術(shù)后分別在1周和4周取材，制作組織切片鏡下觀察支架與周圍組織的反應(yīng)以評價(jià)其組織相容性。利用Ⅰ型膠原酶酶解天然神經(jīng)和Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)，比較二者的膠原穩(wěn)定性，從而評價(jià)其降解情況。將人牙髓前體細(xì)胞植入Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)支架，通過EdU試驗(yàn)，觀察細(xì)胞在支架上生長的排列模式。將牙髓前體細(xì)胞與Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)浸提液共培養(yǎng)，通過實(shí)時(shí)熒光PCR

8、相對定量分析支架浸提液對牙髓前體細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平的影響。
　　結(jié)果:牙髓前體細(xì)胞與Myroilysin脫細(xì)胞神經(jīng)浸提液共培養(yǎng)4天至6天后，其增殖活性高于其單獨(dú)培養(yǎng)，表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性;該支架材料植入大鼠背部皮下后，雖在植入早期出現(xiàn)急性炎癥，但隨即呈現(xiàn)組織修復(fù)過程，未出現(xiàn)不良反應(yīng)，具有良好的組織相容性。Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的降解速率與天然神經(jīng)基本一致。Myroilysin脫細(xì)胞

9、異種神經(jīng)支架可使牙髓前體細(xì)胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長方式。牙髓前體細(xì)胞與Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架浸提液共培養(yǎng)后，神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF和BDNF在mRNA水平出現(xiàn)了上調(diào)。
　　結(jié)論:Myroilysin脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架具有良好的生物相容性和體外降解速率，其多孔的縱形溝壑狀結(jié)構(gòu)可發(fā)揮“地形誘導(dǎo)”作用，同時(shí)其保留較好的周圍神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)成分具有一定的生物學(xué)誘導(dǎo)，可使牙髓前體細(xì)胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長，