小干擾RNA引發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)mdr1基因沉默的研究.pdf

1、應(yīng)用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)多藥耐藥基因(mdr1)的表達(dá).以pSilencer3.1-H1 Hypro質(zhì)粒載體為基礎(chǔ),通過(guò)DNA重組技術(shù),在載體中插入一段設(shè)計(jì)的序列,構(gòu)建成新的質(zhì)粒.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MCF-7/ADR細(xì)胞中,在質(zhì)粒本身具有的H1 RNA聚合酶啟動(dòng)子作用下,以細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄出具有3'突出末端的發(fā)卡RNA.此發(fā)卡RNA作為小干擾RNA,封閉MCF-7/ADR細(xì)胞的mdr1基因,使其所表達(dá)的蛋白P-170減少

2、,逆轉(zhuǎn)MCF7/ADR細(xì)胞的多藥耐藥性.從而驗(yàn)證小干擾RNA在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)引發(fā)特異性基因沉默,期望為基因治療開(kāi)辟一條新的途徑.結(jié)果:1.成功構(gòu)建具有設(shè)計(jì)插入序列的pSilencer 3.1-H1 hypro質(zhì)粒,通過(guò)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜和測(cè)序分析,插入載體的核苷酸序列和設(shè)計(jì)完全體符合.2.轉(zhuǎn)染質(zhì)粒到細(xì)胞中,篩選轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞.3.經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),MCF-7/ADR細(xì)胞P-170表達(dá)率由99.8﹪下降到12.3﹪;轉(zhuǎn)染過(guò)GFP基因的L