哺乳動物基因工程

1、四、高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移,第十六章 哺乳動物基因工程,三、高等哺乳動物的載體系統(tǒng),二、高等哺乳動物的受體系統(tǒng),一、高等哺乳動物基因工程的基本概念,,五、利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白,一、 高等哺乳動物基因工程的基本概念,第六節(jié) 哺乳動物基因工程,高等哺乳動物基因工程,高等哺乳動物細(xì)胞基因表達(dá)技術(shù),高等哺乳動物轉(zhuǎn)基因技術(shù),,,轉(zhuǎn)基因動物個體,動物工程細(xì)胞,,,哺乳動物遺傳性狀改良,藥物篩選研究評價模型,人體基因治療,蛋白

2、多肽物質(zhì)大規(guī)模生產(chǎn),藥物篩選研究評價模型,二、 高等哺乳動物的受體系統(tǒng),1、高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性2、高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件3、高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記4、常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞,,第十六章 哺乳動物基因工程,1、高等哺乳動物細(xì)胞的生長特性,正常的哺乳類動物細(xì)胞具有下列四大生物學(xué)特征：,錨地依賴性：細(xì)胞必須附在固體上或固定的表面才能生長分裂,血清依賴性：細(xì)胞必須具有生長因子才能生長,接觸抑制性：細(xì)胞與細(xì)胞接觸后

3、，生長便受到抑制,形態(tài)依賴性：細(xì)胞稱扁平狀，并有長纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),,,,,上述特征使得正常的哺乳動物細(xì)胞在體外培養(yǎng)中，一般只能存活50代,且在培養(yǎng)皿上以平面的形式生長，即單層細(xì)胞生長。有時，正常細(xì)胞,會改變某些特征而越過生理臨界點(diǎn)，繼續(xù)增殖并無限制分裂，這種狀,態(tài)稱為細(xì)胞系形成，此時的細(xì)胞成為細(xì)胞系。,2、高等哺乳動物受體細(xì)胞的條件,以高效表達(dá)外源基因?yàn)槟繕?biāo)的高等哺乳動物受體細(xì)胞應(yīng)具備下列條件,細(xì)胞系特征 喪失細(xì)胞接觸抑制性和錨地依

4、賴性特征，便于大 規(guī)模培養(yǎng),遺傳穩(wěn)定性 外源基因多次傳代后不至于丟失，易于長期保存,合適的標(biāo)記 便于轉(zhuǎn)化株的篩選和維持,生長快且齊 分裂周期短，生長均一，便于控制,,,,,大多數(shù)正常的高等哺乳動物細(xì)胞并不能同時具備上述條件，癌細(xì)胞能,安全性能好 不合成分泌致病物質(zhì)，不致癌,,滿足上述前四項(xiàng)要求，但在安全性能上有欠缺。

5、,3、高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞,5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）,,,,次黃嘌呤核苷一磷酸（HMP）,,,次黃嘌呤核苷（HR）,,GMP,,AMP,尿嘧啶核苷一磷酸（UMP）,胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP）,,胸腺嘧啶核苷（TR）,嘌呤核苷酸生物合成途徑,嘧啶核苷酸生物合成途徑,次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶,（HPRT）,（TK）,胸腺嘧啶核苷激酶,,氨基喋呤（AP）,,氨基喋呤（AP）,,,從頭合成

6、途徑,補(bǔ)救合成途徑,3、高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,營養(yǎng)缺陷型的哺乳動物受體細(xì)胞,含有胸腺嘧啶核苷激酶（TK）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（tk -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因tk能與之遺傳互補(bǔ)含有次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HPRT）編碼基因缺陷的受體細(xì)胞（hprt -）不能在含有次黃嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)基上（HAT培養(yǎng)基）生長，載體上的標(biāo)記基因hprt與

7、之遺傳互補(bǔ),,,,3、高等哺乳動物受體細(xì)胞的遺傳標(biāo)記,哺乳動物受體細(xì)胞常見的遺傳選擇標(biāo)記,,遺傳標(biāo)記,編碼產(chǎn)物,篩選藥物,作用機(jī)理,,APH- 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶 G418 APH滅活G418,DHFR 二氫葉酸還原酶 氨甲喋呤 DHFR變體抗氨甲喋呤,HPH- 潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶 潮霉素B HPH滅活潮霉素B,TK- 胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤

8、 TK合成TMP,XGPRT- 黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶 霉酚酸 XGPRT合成GMP,ADA- 腺嘌呤核苷脫氨酶 腺嘌呤木酮糖苷 ADA滅活Xyl-A,,4、常用的高等哺乳動物受體細(xì)胞,迄今為止，用于醫(yī)療用品（藥物、抗體、診斷試劑）大規(guī)模生產(chǎn),的高等哺乳動物受體細(xì)胞主要還是中國倉鼠卵巢細(xì)胞（CHO），其優(yōu),勢有如下幾個方面：,遺傳背景清楚，生理代謝穩(wěn)定,與人的親緣關(guān)系接近，外源蛋白修飾準(zhǔn)確,

9、基因轉(zhuǎn)移和載體表達(dá)系統(tǒng)完善,耐受剪切力，便于大規(guī)模培養(yǎng),被美國FDA確認(rèn)為安全的基因工程受體細(xì)胞（GRAS）,,,,,,三、 高等哺乳動物的載體系統(tǒng),,,,1、人腺病毒DNA,2、猴空泡病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,,4、人牛痘病毒DNA,第十六章 哺乳動物基因工程,1、人腺病毒DNA,腺病毒科為線狀雙鏈DNA病毒，無包膜，呈二十面體，共有93個,成員，分哺乳動物腺病毒和禽腺病毒兩個屬。目前已鑒定的人腺病毒

10、,腺病毒的生物學(xué)特性,有6個亞屬，其中常用來構(gòu)建載體的主要是C亞屬的2型（Ad2）和5型,（Ad5）病毒。,腺病毒感染人細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但對嚙齒目動物來說，,絕大多數(shù)的腺病毒成員均能致癌。,腺病毒的基因組DNA,,,,,,,,,,,,,,,ITR,ITR,E1,E2,E3,E4,IVa2,VA,L1,L2,L3,L4,L5,腺病毒基因組DNA全長36 kb，其包裝上限為原基因組的105%， DNA兩端各有,一個反向重復(fù)序列（IT

11、R）；E1-E4為早期基因，與病毒基因組的復(fù)制及晚期基因的,表達(dá)調(diào)控有關(guān)，其中E3編碼晚期基因的調(diào)控因子， L1-L5為編碼病毒包裝蛋白的晚期,基因；IVa2和VA均為病毒RNA聚合酶的亞基編碼基因。E3區(qū)缺失只會影響病毒顆粒,的成熟，不影響基因組的復(fù)制功能，因而在構(gòu)建載體時往往除去這個2.2 kb的片段，,使得載體的裝載量提高到4 kb以上。,1、人腺病毒DNA,基因重排低 外源基因與病毒DNA重組后能穩(wěn)定復(fù)制幾個周期,腺病毒DN

12、A載體的特點(diǎn),安全性能好 不整合人的染色體DNA，不會導(dǎo)致惡性腫瘤,宿主范圍廣 對受體細(xì)胞是否處于分裂期要求不嚴(yán)格,使用效果好 外源基因在載體上容易高效表達(dá),1、人腺病毒DNA,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,SV40屬于乳多瘤病毒科多瘤病毒屬，呈小型二十面體，由VP1、,VP2、VP3三種衣殼蛋白包裝而成，基因組為5224bp的雙鏈環(huán)狀DNA,a. SV40的生物學(xué)特性,SV40可以與所有哺乳動物宿主細(xì)胞中的組蛋白H2、

13、H3、H4結(jié)合，從,而使其DNA形成類似核小體的微型染色體結(jié)構(gòu)。,SV40感染猴細(xì)胞時呈裂解型，不致癌；但感染嚙齒類動物后，,便發(fā)生非同源整合而致癌。,b.SV40的基因組DNA,t / T基因編碼病毒的小抗原和大,抗原與病毒的致癌作用密切相關(guān),SV40在裂解宿主細(xì)胞前的晚期,狀態(tài)時，每個宿主細(xì)胞含有105個病,毒DNA拷貝，因此十分適合用于高效,表達(dá)外源蛋白,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,c.SV

14、40 DNA-質(zhì)粒DNA雜合載體的構(gòu)建,重組的SV40 DNA分子必須經(jīng)過,包裝后才具有感染能力，因此插入的,外源DNA片段不能太大。為了盡量提,高SV40的裝載量，必須刪除一些基因,片段，因此重組的SV40分子必須與野,生型病毒共感染受體細(xì)胞，才能形成,有感染力的重組病毒顆粒。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Apr,ori,viral gene,gpt,SV40 ori,pV2-GPT,,,,,pBR322,pBR322,

15、,,SV40,pV2-GPT是一種SV40 DNA與大腸桿菌質(zhì)粒DNA雜合的載體，其,中g(shù)pt為細(xì)菌來源的谷氨酸-丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因，用于篩選重組子。該,載體曾被成功地用于在猴腎細(xì)胞中表達(dá)有生物活性的兔b-珠蛋白.,d.利用SV40 DNA載體表達(dá)外源基因的程序,SV40 載體,病毒晚期基因啟動子,,篩選標(biāo)記,ori,缺陷的SV40 輔助病毒,,去除細(xì)菌序列,插入外源基因,重組分子,,分離病毒DNA,,,,,轉(zhuǎn)化,,,,,,,,,,,,,

16、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,篩選,增殖,感染,3、猴多瘤病毒DNA（SV40）,基因表達(dá)好 外源基因能高效表達(dá),SV40 DNA載體的特點(diǎn),基因重排高 病毒基因組和重組分子常發(fā)生重排和缺失現(xiàn)象,宿主范圍窄 只能轉(zhuǎn)染猴細(xì)胞,裝載量較小,2、猴多瘤病毒DNA（SV40）,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,人乳多瘤病毒（BKV）屬于乳多瘤病毒科乳頭瘤病毒屬，其基因,組為雙鏈DNA，感染宿主細(xì)胞后基因不發(fā)生整合，

17、獨(dú)立于染色體而自,a. 人乳多瘤病毒的生物學(xué)特性,主復(fù)制，每個宿主細(xì)胞最高可達(dá)500個拷貝,3、人乳多瘤病毒DNA（BKV）,b. 人乳多瘤病毒表達(dá)載體的構(gòu)建,BKV - E.coli 穿梭載體,BKV ori,BKV gene,DRE,MMTP,Ap r,E.coli ori,SV40 P,Neo r,刪除編碼病毒核心蛋白和外殼蛋白的,基因，并與大腸桿菌質(zhì)粒拼接，構(gòu)成,穿梭載體，它不能整合，同時也不能,形成成熟的病毒顆粒裂解受體細(xì)

18、胞。,安裝細(xì)胞色素P450 dioxin介導(dǎo)的增強(qiáng),子DRE，控制小鼠乳腺癌啟動子MMTP，由其帶動外源基因的表達(dá)。,SV40來源的啟動子控制Neor 標(biāo)記基因，以G418篩選重組子。,以此載體在人細(xì)胞系中表達(dá)b1-干擾素和單純皰疹病毒B蛋白獲得成功。,4、人牛痘病毒DNA,人牛痘病毒是一個大型DNA病毒，基因組長185 kb，能在宿主細(xì),胞質(zhì)中自主復(fù)制。以前外源基因插在病毒基因組的非必需區(qū)內(nèi)，構(gòu)建,a. 人牛痘病毒的生物學(xué)特性,出的重

19、組病毒具有感染力，而且一經(jīng)轉(zhuǎn)染，外源基因即可在最鄰近的,病毒啟動子的控制下高效表達(dá)。然而由于牛痘病毒基因組較大，體外,DNA重組很困難，因此通常采用體內(nèi)重組的方式進(jìn)行。,4、人牛痘病毒DNA,目前廣泛使用的牛痘病毒表達(dá)系統(tǒng)是一種預(yù)先構(gòu)建好的重組病毒,其基因組上插入了一個可表達(dá)的大腸桿菌T7RNA聚合酶編碼基因。在,b.人牛痘病毒DNA表達(dá)載體的構(gòu)建,外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞之前，先以上述的重組病毒感染細(xì)胞，使其大,量表達(dá)T7RNA聚合酶，然

20、后再將含有外源基因和T7啟動子的細(xì)菌型重,組質(zhì)粒導(dǎo)入哺乳動物受體細(xì)胞，此時外源基因整合在受體細(xì)胞染色體,DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表達(dá)出重組蛋白。,人囊狀纖維化基因就是采用這種戰(zhàn)略高效表達(dá)的。,4、人牛痘病毒DNA,c. 利用人牛痘病毒載體表達(dá)外源基因的程序,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,牛痘病毒啟動子,T7 RNA聚合酶基因,T7啟動子,外源基因,細(xì)

21、菌重組質(zhì)粒,感染,轉(zhuǎn)化,培養(yǎng),收集,四、 高等哺乳動物的基因轉(zhuǎn)移,,,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,（二）哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá),盒中不含任何病毒基因序列，這對外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕,了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨,機(jī)整合在染色體DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化

22、法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解在磷酸緩沖液中，加入CaCl2溶液混勻，此,時DNA被包裹在磷酸鈣晶體顆粒內(nèi)；,此時細(xì)胞膜形成吞噬泡，磷酸鈣晶體局部溶解膜結(jié)構(gòu)，DNA便進(jìn)入受,體細(xì)胞；,1.磷酸鈣共沉淀法,將上述制備的顆粒懸浮液滴入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，37℃保溫4-16小時,棄去DNA溶液，加入新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)7天即可篩選轉(zhuǎn)化株。,如果在外源DNA中摻入少量的受體細(xì)胞內(nèi)源性DNA可以提高轉(zhuǎn)化,效率。利用磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)化腫瘤病毒DNA，可使正常細(xì)

23、胞轉(zhuǎn)化為,癌細(xì)胞，這是人們對腫瘤發(fā)生機(jī)制的最早理解。,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解受體細(xì)胞懸浮液中，然后加入電擊轉(zhuǎn)化儀的,樣品槽內(nèi)，兩端施加瞬時高壓電場，使細(xì)胞膜產(chǎn)生細(xì)小的縫隙，此時,電擊轉(zhuǎn)化法常用于對磷酸鈣共沉淀法無效的細(xì)胞類型，如生長在,懸浮液中的淋巴細(xì)胞等。,2. 電擊轉(zhuǎn)化法,DNA片段便可不經(jīng)過胞飲作用直接進(jìn)入受體細(xì)胞。,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,將待轉(zhuǎn)化的DNA溶解與天然或人工合成的磷脂混合，后者

24、在表面,活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。,合，DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。,利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和HeLa,3. 脂質(zhì)體介導(dǎo)法,將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會與受體細(xì)胞膜融,細(xì)胞。,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,通過激素療法使雌鼠超數(shù)排卵，并與雄性小鼠交配，然后殺死雌,鼠，從其輸卵管內(nèi)取出受精卵；,性原核內(nèi)。,上述程序多用于動物個體的轉(zhuǎn)基因過程，由于必須單細(xì)胞逐一操,4. 顯微注射

25、法,借助于顯微鏡將純化的DNA溶液迅速注入到受精卵中變大了的雄,作，所以不太適用于基因的克隆和表達(dá)。,（一）哺乳動物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法,血影細(xì)胞是指哺乳動物的紅細(xì)胞在機(jī)械作用、病毒誘導(dǎo)、低滲環(huán),境下發(fā)生溶血，血紅蛋白大量溢出，最后形成僅被細(xì)胞膜包裹的細(xì)胞,同時，外源DNA也容易進(jìn)入。當(dāng)上述外界條件消失后，紅細(xì)胞膜又可,恢復(fù)原來的通透性。因此，可先將外源DNA轉(zhuǎn)入血影細(xì)胞，然后再將,5.血影細(xì)胞介導(dǎo)法,核結(jié)構(gòu)。在溶血過程中，紅細(xì)胞膜的通透性

26、大增，在血紅蛋白溢出的,血影細(xì)胞與受體細(xì)胞在適當(dāng)條件下發(fā)生融合，從而將外源DNA轉(zhuǎn)入受,體細(xì)胞。,（二）哺乳動物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法,以病毒DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染或與野生型病毒顆粒,共轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo),入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍,有限，往往無法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價值的家禽和牲畜細(xì)胞等。,五、 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白,,,1.哺乳動物細(xì)胞高效

27、表達(dá)外源蛋白的基本原理,2.利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,3. 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織型纖溶酶原激活劑,,4. 利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊,方式。氨甲喋呤（MTX）是動物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶二氫葉酸還原酶,數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò),增。這些抗性細(xì)胞正是通過增加相關(guān)基

28、因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶,通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因,（DHFR）的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多,的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū),哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象,域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于dhfr基因本身，即與dhfr基因相鄰的DNA區(qū)域同時被擴(kuò)增。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因,DHFR-MTX高效表達(dá)系統(tǒng),,,,,,,,,,,,,,,,外源基因,dh

29、fr,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,轉(zhuǎn)染dhfr -細(xì)胞系,單克隆,培養(yǎng),轉(zhuǎn)移,0.05 mM MTX,培養(yǎng),單克隆,轉(zhuǎn)移,培養(yǎng),單克隆,轉(zhuǎn)移,5 mM MTX,0.25 mM MTX,,培養(yǎng),單克隆,外源基因擴(kuò)增至100拷貝,,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表

30、達(dá)外源基因,GS-MSX高效表達(dá)系統(tǒng),谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亞砜（MSX）對動物細(xì),胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動物細(xì),中不必使用GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的MSX濃度下就能篩,選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是GS-MSX系統(tǒng)比DHFR-,胞中，由于只有多拷貝的GS編碼基因才能抗MSX，所以在轉(zhuǎn)染過程,MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理,通過強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表

31、達(dá)外源基因,在載體上安裝病毒或細(xì)胞來源的強(qiáng)啟,,,,,,mRNA前體,,,,AAAAAAAAA,mRNA,動子以及有效的翻譯元件，也是使外源基,因高效表達(dá)的一種手段，如：,細(xì)胞巨化病毒CMV的啟動子,動物珠蛋白基因的內(nèi)含子,SV40的終止子和polyA化信號序列,絕大多數(shù)哺乳動物細(xì)胞的表達(dá)型載體,上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)閙RNA前體的剪,切能促進(jìn)成熟mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利,于翻譯。有的還含有各種信號肽序列。,哺乳動物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋

32、白的基本原理,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)的重組蛋白,迄今為止，已有大約300種重組蛋白藥物正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，但,在哺乳動物工程細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)的只有少數(shù)幾種：,b 干擾素g 干擾素,凝血因子VIII凝血因子IX,促紅細(xì)胞生成素（EPO）生長因子（hGH）,白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原,單克隆抗體 CD4受體,組織型纖溶酶原激活劑（tPA）,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體,大多數(shù)惡性淋巴

33、,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,Neor,鼠金屬硫蛋白啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體輕鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pL,,,,,,,,,,,,,,,,dhfr,SV40啟動子,b 肌動蛋白啟動子,抗體重鏈cDNA,b 肌動蛋白終止子,pH,,,,,,,,,,,,,,瘤細(xì)胞表面上都,有一種特異性的,糖蛋白campath,用人源化的小鼠,抗campath抗體,治療非霍金淋巴,細(xì)胞瘤患者，效,果良好。重組抗,體

34、采用DHFR-M,TX系統(tǒng)表達(dá)。,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑,第一個由重組哺乳動物,dhfr,啟動子,人tPA cDNA,終止子,細(xì)胞規(guī)?；a(chǎn)的醫(yī)用蛋白,是治療急性心肌梗塞的溶血,栓藥物：人組織纖溶酶原激,活劑（tPA）。同樣采用,DHFR-MTX系統(tǒng)表達(dá)，受體,細(xì)胞選用CHO系統(tǒng)。目前，,用該工藝路線生產(chǎn)的重組人tPA已經(jīng)商品化。,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,信號肽編碼序列,此外

35、，人tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。,利用哺乳動物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子VIII,凝血因子VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來，血友病,病人都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII生物制品進(jìn)行治療，然,而由于人的血源污染乙肝病毒或愛滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制,品的血友病人慘遭感染，其中10%的病人最終死于愛滋病而非血友病。,早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子VIII的cDNA便已被克隆和鑒,定，血源的污