2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、本文研究目的:脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞,包括人胚腎細(xì)胞(humallembryonickidneyepithelialcell,HEK293)和乳鼠心肌細(xì)胞,研究在HEK293細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)后的hHCN2通道電流(IhHCN2)特點(diǎn),并研究胺碘酮對(duì)IhHCI,12的急性作用;研究乳鼠心肌細(xì)胞起搏電流(1f)及其基因表達(dá)情況,觀察起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)的影響,以及質(zhì)粒hHCN

2、2/pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞后對(duì)其自發(fā)性搏動(dòng)的影響,探討If在乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)的作用,為緩慢心律失常的生物起搏基因治療提供依據(jù)。 方法:質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)化大腸桿菌JMl09,以中量質(zhì)粒抽提試劑盒提取、純化。采用脂質(zhì)體介導(dǎo)hHCN2/pcDNA3轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,加入G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選,獲得穩(wěn)定的G418抗性的HEK293細(xì)胞系,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄IhHCN2的電生理特點(diǎn)以及胺碘酮對(duì)IhHCN2

3、的急性作用,RT-PCR及westernblot檢測(cè)hHCN2通道的mRNA和蛋白表達(dá)情況。分離、培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞,脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/peDNA3轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞,利用膜片鉗技術(shù)、RealtimePCR及Westernblot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后乳鼠心肌細(xì)胞的起搏電流及其HCN.mRNA表達(dá),觀察起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+以及起搏通道基因hHCN2轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞對(duì)乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)的影響。 結(jié)果: 1.脂質(zhì)

4、體轉(zhuǎn)染法將hHCN2基因?qū)際EK293細(xì)胞,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定篩選的HEK293細(xì)胞用膜片鉗技術(shù)記錄到超極化內(nèi)向電流hHCN2,.80mV~-90mV開始激活,激活緩慢,沒有明顯失活過程,呈電壓、時(shí)間依賴性激活。RT-PCR和Westernblot明顯檢測(cè)到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞有hHCN2mRNA和蛋白表達(dá)。 2.細(xì)胞外液K+濃度為30mM時(shí),IhHCN2的反轉(zhuǎn)電位17_3mV(艫10),PNa/PK為0.24;降低外液Na

5、+濃度和K+濃度,IhHCN2電流密度減??;測(cè)試電位一140mV時(shí),0.5gmol/L、5gmol/L、101.tmol/L、251.tmol/L、50gmol/L、100gmol/LZD7288降低IbHCN2峰值電流分別n.6±3.6%、22.1±7.7%、37.8±10.8%、62.1±5.2%、83.2±8.0%和99.5±O.8%,濃度反應(yīng)曲線預(yù)測(cè)的半效抑制濃度(IC50)為23.9±5.9].tmol/L,在沖洗后ZD728

6、8抑制作用不能恢復(fù);測(cè)試電位一140mV,1gmol/L、101.tmol/L、100gmol/L、1000gmol/L、100001.tmol/LCs+降低IhHCN2峰值電流分別0.8±O.3%、12.14-4.7%、44.9±4.2%、87.1±5.5%和99.3±O.3%,濃度反應(yīng)曲線預(yù)測(cè)的半效抑制濃度(IC50)為126.8±27.1[tmoVL。沖洗后Cs+抑制作用迅速恢復(fù);100gmol/LcAMP灌流,IhHCN2無明顯

7、變化,電極內(nèi)液中加入終濃度為100gmol/L的cAMP,IhHCU2激活加快,激活時(shí)間加快,Vm為一86+2mV,向正向移動(dòng)12mY(n=8,p<0.05)。 3.以0.011xmol/L、O.1pmol/L、1gmol/L、10gmol/L、100gmol/L胺碘酮降低Ih.cs2峰值電流分別4.6±1.8%、u.4-t-63%、39.6±4.1%、78.8±3.4%和83.7±2.4%,濃度反應(yīng)曲線預(yù)測(cè)的半效抑制濃度(IC

8、50)為1.21±0.23gmol/L,10gmol/L胺碘酮灌流使各鉗制電壓下Ih~cS2激活緩慢,在測(cè)試電壓一140mV時(shí),激活時(shí)間常數(shù)由189±38ms延長(zhǎng)為320±57ms(艫5,p<0.05),胺碘酮可阻滯IhHCN2,沖洗后抑制作用無明顯恢復(fù)。 4.培養(yǎng)的心肌細(xì)胞在第3~10d細(xì)胞形態(tài)、搏動(dòng)良好,全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)在82%(27/33)乳鼠心肌細(xì)胞中可以記錄到起搏電流(If),乳鼠心肌細(xì)胞膜電容15±2pF(n:20)

9、,If在.80mV左右激活,Vm為87±6mV,電流密度18~7pA/pF(n=6,電壓140mY).5mMCs+可以阻斷超極化內(nèi)向電流,實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)乳鼠左心室心肌HCN2和HCN4基因的mRNA表達(dá),HCN2:HCN4為5.56±L3。 5.起搏電流阻斷劑20μMZD7288和lmmCs+可以抑制乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng),分別使乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率降低28%、36%。 6.轉(zhuǎn)基因乳鼠心肌細(xì)胞有hHCN2的mR

10、NA和蛋白表達(dá),對(duì)照組乳鼠心肌細(xì)胞沒有檢測(cè)到。hHCN2/pcDAN3轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞3d后,其自發(fā)性搏動(dòng)頻率為103+14次/分鐘,轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒pcDNA3的對(duì)照組為65+15次/分鐘(n=12,p<0.01)。 結(jié)論: 1.脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒hHCN2/pcDNA3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞成功,獲得了持續(xù)表達(dá)hHCN2通道的HEK293細(xì)胞株,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的通道電流相類似,建立了研究克隆離子通道結(jié)構(gòu)與功能的模型。

11、 2.穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞的IhHCN2具有天然If特點(diǎn),為超極化激活、cAMP直接激活、Na+/K*通透,起搏電流阻斷劑Cs+、ZD7288可以阻斷IhHCN2。 3.胺碘酮明顯抑制hHCN2,為治療器質(zhì)性心臟病患者心律失常提供新理論依據(jù)。4.起搏電流阻斷劑ZD7288和Cs+可以抑制乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng),起搏通道基因hHCN2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染乳鼠心肌細(xì)胞可以使乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)頻率增加,提示If是乳鼠心肌細(xì)胞自發(fā)性搏動(dòng)

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