馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠脊髓組織蛋白質組學及相關基因分析.pdf

1、目的先天性馬蹄內(nèi)翻足(congenitaltalipesequinovarus，CTEV；congenitalclubfoot，CCF)是一種兒童常見的嚴重影響足功能的先天畸形，發(fā)病率約為0.064～0.8％，男女之比約為2.0～2.5∶1，在活產(chǎn)胎兒中發(fā)生率約為1‰，雙側同時發(fā)病占50％，右足多于左足。主要畸形包括前足內(nèi)收、踝跖屈、跟骨內(nèi)翻以及繼發(fā)性脛骨遠端內(nèi)旋。畸形不影響患兒生存和生育，但嚴重影響其生活質量。病因目前還不清楚，有多種

2、學說，如：神經(jīng)肌肉病變，血管發(fā)育異常，骨骼發(fā)育異常，軟組織異常，遺傳基因學說以及宮內(nèi)發(fā)育阻滯學說等。部分學者在某一領域達成共識，如：神經(jīng)肌肉病變學說，但尚無定論。遺傳流行病學研究表明，遺傳因素是馬蹄內(nèi)翻足發(fā)病主要原因之一。 蛋白質廣泛參與細胞的功能及調節(jié)，蛋白質組決定細胞乃至組織和器官的表型。不論是處于正常狀態(tài)還是急慢性疾病狀態(tài)，表型都是多種多樣的。蛋白質組學是一個新興的研究領域，其核心在于大規(guī)模地對蛋白質進行綜合分析，通過對某

3、物種、個體、器官、組織或細胞的全部蛋白質性質(包括表達水平、結構、翻譯后修飾、細胞內(nèi)定位、蛋白質相互作用等)的研究，對蛋白質所執(zhí)行的生理性、病理性生命活動做出最精細、最準確、最本質的闡述。表達蛋白質組學是現(xiàn)今應用最為廣泛的蛋白質組學研究模式。該策略的技術路線主要是通過雙向凝膠電泳建立蛋白質組圖譜、用專業(yè)圖像掃描分析軟件進行圖像分析、通過質譜及蛋白質數(shù)據(jù)信息處理技術進行蛋白質的鑒定與分析。 本實驗在全反式維甲酸(alltrans-

4、retinoicacid，ATRA)誘導大鼠動物模型的基礎上，采用雙向電泳的方法對脊髓組織蛋白質組進行分離，通過軟件分析和質譜-生物信息學方法尋找疾病相關蛋白質，通過該蛋白質進一步尋找馬蹄內(nèi)翻足疾病相關基因。 前期通過對胎鼠脛骨后肌組織的蛋白質組學的實驗分析，發(fā)現(xiàn)慢骨骼肌肌鈣蛋白T(slowskeletalmuscletroponinT，sTnT；troponinT，slowskele-talmuscle，TnTs)在模型胎鼠中

5、未見表達，本實驗采用RT-PCR方法，進一步分析該蛋白的編碼基因—Tnnt1—與馬蹄內(nèi)翻足疾病發(fā)生的關系。 方法1.建立馬蹄內(nèi)翻足大鼠胚胎模型 1.1將孕10d的Wistar大鼠隨機分為對照組和實驗組，按135mg/kg體重用灌胃法給予實驗組大鼠ATRA，對照組給予相應體積礦物油。 1.2孕21d剖腹取出胚胎，分離脊髓、踝部骨骼(下肢踝關節(jié)上2mm至足正中，去除肌肉、皮膚組織)及踝部肌肉(下肢踝關節(jié)上2mm至足正

6、中，去除骨骼、皮膚組織)。 2.模型胎鼠與對照胎鼠脊髓組織蛋白質組差異分析 2.1提取胎鼠脊髓組織的總蛋白質，Bradford法進行蛋白定量。 2.2等電聚焦使用PROTEANIEF等電聚焦儀。聚焦后的膠條經(jīng)兩步平衡后進行SDS-PAGE電泳，染色、掃描后用PDQuest7.1.0進行圖像分析，尋找差異蛋白點。 2.3切取差異點并進行質譜和生物信息學分析。 3.Tnnt1在模型胎鼠和對照胎鼠中表達

7、情況分析 3.1用TRIzol試劑分別提取模型胎鼠和對照胎鼠的脊髓、踝部骨骼和踝部肌肉的總mRNA。 3.2用RT-PCR方法檢測該基因在三種組織中的表達情況，進一步分析Tnnt1與馬蹄內(nèi)翻足畸形的相關性。 結果1.成功重復構建了馬蹄內(nèi)翻足樣畸形大鼠模型 孕21d剖檢共獲取胎鼠344只，其中對照組112只，實驗組232只。對照組CCF樣畸形發(fā)生率為零；實驗組CCF樣畸形發(fā)生率為80.98％，其中單純CCF

8、發(fā)生率達29.27％。 2.模型胎鼠和對照胎鼠脊髓組織雙向電泳圖譜差異分析結果 使用寬pH(pH3-10)膠條和窄pH(pH5-8)膠條所獲圖譜均顯示多數(shù)蛋白質點匹配良好。在兩種圖譜中：模型胎鼠中分別有13～15和8～10個蛋白點明顯上調，15～17和10～12個蛋白點明顯下調，有9～11和11～13個蛋白點僅在對照胎鼠中表達，7～9和10～13個蛋白點僅在模型胎鼠中表達。 3.模型胎鼠和對照胎鼠脊髓組織蛋白質組

9、分析結果 選取界限清楚、重復性好的6個差異蛋白點進行質譜鑒定。6個點的質譜結果均為陽性。經(jīng)生物信息學數(shù)據(jù)庫檢索后，檢索結果陰性者1個，檢索結果陽性者5個(其中2個點的數(shù)據(jù)庫查詢結果一致)，初步鑒定的結果分別為：烯醇酶(僅表達于對照胎鼠)、ATP合酶F1復合體組裝因子2(僅表達于模型胎鼠)、微管蛋白β鏈(模型胎鼠下調5倍以上)和載脂蛋白A-Ⅰ(模型胎鼠上調5倍以上)。 4.Tnnt1基因在馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠中的表達

10、 半定量RT-PCR分析結果表明，70.0％(21/30)的馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠踝部骨骼和76.7％(23/30)的踝部肌肉組織中Tnnt1表達下調，在脊髓組織中基本無表達。 結論1.首次應用雙向電泳技術獲得了重復性好的孕21d胎鼠脊髓組織蛋白質組雙向電泳圖譜。 2.首次分析了馬蹄內(nèi)翻足模型胎鼠與對照胎鼠脊髓組織蛋白質組差異，模型胎鼠的烯醇酶沒有表達，微管蛋白表達下調，載脂蛋白表達上調，而ATP合酶F1復合體組裝因子2僅在