腺病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)海馬腦片缺血再灌注模型中NgR表達(dá)的影響的研究.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)損傷后再生障礙的主要原因是由于髓磷脂抑制分子的存在，目前證實(shí)存在的抑制分子有Nogo-A、髓鞘相關(guān)糖蛋白(myelin associated glycoprotein,MAG)、少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘糖蛋白(oligodendrocyte-myelin glycoprotein,OMgp)，NgR是一種神經(jīng)元軸突表面蛋白，是三種抑制蛋白的共同受體，與p75(neurotrophin p75receptor)，LINGO-1或T

2、ROY形成受體復(fù)合物，是抑制信號(hào)向神經(jīng)元胞內(nèi)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，因此，預(yù)測(cè)將其阻斷有可能促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后軸突的再生。本課題的目的是在于利用NgR特異性RNAi(RNAinterference RNA干擾)的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染離體海馬腦片缺血再灌注模型，觀察NgR基因沉默對(duì)中樞神經(jīng)缺血性損傷后軸突再生的影響，闡明NgR在中樞神經(jīng)(central nervous system,CNS)軸突再生障礙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用，以期為臨床腦缺血后

3、神經(jīng)康復(fù)的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：1．離體培養(yǎng)9-11天Sprague-Dawley(SD)大鼠海馬腦片，制備缺血再灌注模型；2.構(gòu)建NgR特異性RNAi的重組腺病毒載體AD-shRNA-NgR，轉(zhuǎn)染海馬腦片，通過RT-PCR檢測(cè)Ngg mRNA基因沉默情況，篩選最佳干擾片段；3．AD-shRNA-NgR轉(zhuǎn)染海馬腦片48h后，糖氧剝奪30min，分別在復(fù)氧24h,72h,5d三個(gè)時(shí)段，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)NgR mRNA表達(dá)，

4、同時(shí)檢測(cè)缺血再灌注組NgR mRNA的時(shí)相表達(dá)，觀察海馬腦片缺血再灌注后NgR的表達(dá)變化、RNAi對(duì)NgR的抑制效率及抑制效率的維持；再設(shè)立正常對(duì)照組、缺血再灌注組及RNAi干預(yù)組，在缺血再灌注后48h檢測(cè)指標(biāo)，應(yīng)用Western blotting及免疫組化檢測(cè)NgR蛋白表達(dá)，氯化金染色法觀察軸突再生情況，探討NgR對(duì)中樞神經(jīng)缺血性損傷后軸突再生的影響。 結(jié)果：1．腺病毒對(duì)海馬腦片的感染效率及最佳干擾片段的篩選：腺病毒以1.0×

5、10<'9>pfu的病毒量感染海馬腦片時(shí)，感染效率粗測(cè)在90％以上；RT-PCR結(jié)果顯示：三條干擾片段以shRNAd-NgR-2基因沉默效率最高，感染48h后抑制率達(dá)到69％；2.RT-PCR檢測(cè)NgR mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：缺血再灌注后NgR基因表達(dá)各時(shí)相均明顯增高(p<0.05)，72h表達(dá)回落(同24h相比p<0.01)，于5d時(shí)又有增高，但未達(dá)到24h水平(同24h相比p<0.05)，總體呈波動(dòng)性變化；RNAi干預(yù)組較缺血再灌注

6、組NgR mRNA基因表達(dá)明顯減弱(p<0.01)，抑制效率于5d時(shí)降低(p<0.05)，但總體維持在較高水平；Westem blotting及免疫組化檢測(cè)NgR蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：缺血再灌注組NgR蛋白表達(dá)明顯增高(p<0.01)，RNAi干預(yù)組較缺血再灌注組NgR基因表達(dá)明顯減弱(p<0.01)，但未至正常水平(p<0.05)；氯化金染色法觀察軸突再生情況發(fā)現(xiàn)：缺血再灌注組軸突長(zhǎng)度較正常對(duì)照組明顯縮短(p<0.01)，RNAi干預(yù)組較

7、缺血再灌注組軸突有明顯增長(zhǎng)(p<0.01)，但未達(dá)到正常水平(p<0.05)。NgR表達(dá)同軸突再生呈直線負(fù)相關(guān)(r=-0.798，p<0.01)。 結(jié)論：1．本實(shí)驗(yàn)所培養(yǎng)離體海馬腦片培養(yǎng)期間可保持正常的形態(tài)結(jié)構(gòu)；建立的海馬腦片缺血再灌注模型穩(wěn)定、成功，可方便有效的模擬在體腦缺血性損傷。2．成功構(gòu)建了NgR特異性shRNA重組腺病毒載體，并成功篩選出有效干擾片段。 3．海馬腦片缺血再灌注后NgR表達(dá)明顯增高，24h達(dá)到高峰，之后開