腺病毒介導(dǎo)的RNAi對(duì)缺血再灌注大鼠腦內(nèi)NgR表達(dá)、軸突再生和神經(jīng)行為的影響.pdf

1、目的：中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）損傷后軸突再生困難的主要原因是由于髓鞘軸突抑制分子的存在，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的髓鞘抑制蛋白有Nogo-A、髓鞘相關(guān)糖蛋白（myelin associated glycoprotein，MAG）和少突膠質(zhì)細(xì)胞-髓鞘糖蛋白（oligodendrocyte-myelin glycoprotein，OMgp），三者擁有一個(gè)共同的受體（Nogo-66 receptor，NgR）。

2、NgR是一種和糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）相連接的軸突表面蛋白，它和三種抑制因子結(jié)合后，通過(guò)跨膜的協(xié)同受體p75，LINGO-1或TROY形成受體復(fù)合物，將抑制性信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)，從而抑制軸突的再生。因此NgR是整個(gè)抑制環(huán)節(jié)的中樞，預(yù)測(cè)將其阻斷有可能促進(jìn)中樞神經(jīng)損傷后軸突的再生。本課題的目的在于利用以重組腺病毒為載體的NgR特異性shRNA轉(zhuǎn)染缺血再灌注大鼠腦組織，觀察其對(duì)缺血再灌注

3、后大鼠腦組織NgR的表達(dá)、軸突再生及神經(jīng)行為的影響，闡明NgR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）軸突再生障礙信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的重要作用，以期為臨床腦缺血后神經(jīng)康復(fù)的基因治療奠定基礎(chǔ)。 方法：1.應(yīng)用人胚腎293細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒，采用賽多利斯腺病毒純化試劑盒純化病毒，TCID50測(cè)定病毒滴度；2.應(yīng)用高、中、低三種滴度（劑量）的重組腺病毒和腺病毒保存液（陰性對(duì)照）轉(zhuǎn)染大鼠缺血腦組織，采用組織病理

4、學(xué)觀察局部炎癥反應(yīng)，熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白（GFP）的表達(dá)，篩選出最佳的轉(zhuǎn)染滴度；3.采用線栓法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）/再灌注模型，42只大鼠隨機(jī)分為7組：假手術(shù)組，腦缺血2h再灌注24h、2w組（缺血再灌注組）和重組腺病毒載體Ad-shRNA-NgR干預(yù)24h、2w組（腺病毒干預(yù)組），重組腺病毒載體Ad-shRNA-HK干預(yù)24h、2w組（陰性對(duì)照組）。

5、采用RT-PCR檢測(cè)缺血側(cè)皮質(zhì)和海馬NgR mRNA水平，Western blotting檢測(cè)NgR蛋白表達(dá)；4.20只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，缺血再灌注組和腺病毒干預(yù)組，陰性對(duì)照組。腦缺血2h再灌注24h、9w后行增強(qiáng)CT測(cè)量腦梗死體積，術(shù)后每隔一周進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，生物素葡聚糖胺（BDA）神經(jīng)示蹤技術(shù)觀察皮質(zhì)脊髓束和皮質(zhì)紅核束。 結(jié)果：1.重組腺病毒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀察到明確的綠色熒光，擴(kuò)增并純化后Ad-sh

6、RNA-NgR的滴度為：3.16×1010 pfu/ml；Ad-shRNA-HK的滴度為：2.84×1010pfu/ml。 2.高、中、低劑量組大鼠腦組織均出現(xiàn)GFP陽(yáng)性表達(dá)，且高、中劑量組轉(zhuǎn)染效率明顯高于低劑量組，但高劑量組與中劑量組無(wú)明顯差異。HE染色顯示，僅高劑量組中大鼠腦組織有炎性浸潤(rùn)，余均未發(fā)現(xiàn)炎性反應(yīng)。 3.與假手術(shù)組相比，腦缺血2h再灌注24h、2w后，NgR mRNA和蛋白水平均明顯增高（p<0.01），

7、腺病毒干預(yù)后NgR mRNA和蛋白表達(dá)水平下調(diào)（p<0.01），而陰性對(duì)照組中NgR mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化（p>0.05）。 4.增強(qiáng)CT掃描提示腺病毒治療后腦梗塞體積較缺血再灌注組和陰性對(duì)照組沒(méi)有明顯變化（p>0.05），而腺病毒治療3w后，神經(jīng)功能有明顯的恢復(fù)（p<0.01），腺病毒治療9w后健側(cè)皮質(zhì)紅核束發(fā)出側(cè)枝支配病灶側(cè)的數(shù)量明顯增多（p<0.01）。 結(jié)論：腺病毒能高效、低毒地轉(zhuǎn)染缺血腦組織，有效地進(jìn)行