MKL1在巨核細(xì)胞分化過程中的表達(dá)及其對巨核細(xì)胞多倍體化的影響.pdf

1、急性巨核細(xì)胞白血病(Acute Megakaryoblastic Leukemia,AMKL)，在急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)分型中也稱為M7，至少同唐氏綜合癥(Down's syndrome，DS)和t(1；22)(p13；q13)染色體易位兩類染色體異常有關(guān)，伴有骨髓中原始巨核細(xì)胞(megakaryoblast)增加、骨髓纖維化和血小板減少等癥狀。t(1；22)(p13；q13)是AMKL特

2、有的遺傳特征，在1號和22號染色體上形成了RBM15(RNA-binding motif protein15，RBM15)和MKL1(megakaryoblastic leukemia-1，MKL1)的融合基因。目前人們對于RBM15-MKL1融合蛋白在AMKL致病中發(fā)揮的作用所知有限，充分認(rèn)識RBM15和MKL1正常情況下在造血系統(tǒng)中的功能特點(diǎn)有助于了解RBM15-MKL1融合蛋白在AMKL形成、發(fā)展中的作用。目前，關(guān)于MKL1在巨核

3、細(xì)胞發(fā)育中的功能尚未見報道。
　　 本實(shí)驗(yàn)組之前的研究發(fā)現(xiàn)在人紅白細(xì)胞白血病細(xì)胞(human erythroleukemiacells，HEL)中表達(dá)外源MKL1顯著增加了TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate)刺激下巨核細(xì)胞的分化以及多倍體化。為了進(jìn)一步研究MKL1在造血系統(tǒng)巨核細(xì)胞生成(megakaryopoiesis)中的作用，本文以動員人外周血CD34+細(xì)胞(mobilizedh

4、uman peripheral blood CD34+cells，PB CD34+cells)巨核細(xì)胞分化為研究對象，利用實(shí)時定量PCR考察MKL1基因在巨核細(xì)胞分化過程中的表達(dá)情況；通過慢病毒載體在PB CD34+細(xì)胞中表達(dá)MKL1，考察外源MKL1對PB CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞分化、成熟的影響；最后通過構(gòu)建MKL1基因敲除小鼠模型，研究MKL1功能缺陷對小鼠外周血血小板數(shù)量和骨髓中巨核細(xì)胞生成的影響。
　　 主要研究工作

5、和結(jié)果如下：
　　 ①動員人外周血CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞體外兩階段分化模型的建立
　　 建立并優(yōu)化了動員人外周血CD34+細(xì)胞體外分化為巨核細(xì)胞的兩階段培養(yǎng)條件：采用自制的Cocktail培養(yǎng)液和Stem Cell Technologies公司購買的CC100培養(yǎng)液刺激細(xì)胞增殖3天、4天、5天或6天，然后轉(zhuǎn)入含有TPO(thrombopoietin)和SCF(stem cell factor)的分化培養(yǎng)液培養(yǎng)7天、8

6、天或9天，培養(yǎng)結(jié)束后通過比較CD41+細(xì)胞和多倍體細(xì)胞相對初始CD34+細(xì)胞的倍增情況，優(yōu)化培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在本研究范圍內(nèi)，PB CD34+細(xì)胞在Cocktail培養(yǎng)液中擴(kuò)增3天后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)液培養(yǎng)7天，細(xì)胞能獲得16倍數(shù)量的CD41+細(xì)胞和3倍數(shù)量的多倍體巨核細(xì)胞，優(yōu)于其它實(shí)驗(yàn)組。同時，該實(shí)驗(yàn)結(jié)果在CD41+細(xì)胞和多倍體細(xì)胞產(chǎn)量上優(yōu)于目前常用的單階段法體外PB CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞分化條件，可以為巨核細(xì)胞相關(guān)的體外研究提供

7、大量的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來源。
　　 ②MKL1基因在巨核細(xì)胞分化中的表達(dá)
　　 利用流式細(xì)胞儀和BSA非連續(xù)梯度法分離了不同成熟階段的巨核細(xì)胞，實(shí)時定量RT-PCR研究MKL1在不同成熟階段巨核細(xì)胞中的表達(dá)情況：1.5％BSA組(含67.2％CD41+細(xì)胞，1.3％多倍體巨核細(xì)胞)、3％BSA組(含74.4％CD41+細(xì)胞，39.3％多倍體巨核細(xì)胞)和流式分選細(xì)胞組(含98.0％CD41+細(xì)胞，21.5％多倍體巨核細(xì)胞)相對于對

8、照組PB CD34+組(CD41+細(xì)胞和多倍體細(xì)胞含量均為0％)MKL1基因表達(dá)量的平均變化分別為3.0、6.8和5.0倍，均顯著高于PB CD34+組(p＜0.01)。此外，MKL1表達(dá)量流式分選組顯著高于1.5％BSA組(p＜0.01)，3％BSA組顯著高于流式分選組，提示MKL1基因在CD41+細(xì)胞中的表達(dá)量高于未分化的PB CD34+細(xì)胞，在成熟多倍體巨核細(xì)胞中的表達(dá)量高于單核巨核細(xì)胞，即隨著CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞的分化和成

9、熟，MKL1表達(dá)逐漸升高。
　　 ③MKL1外源表達(dá)對PB CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞生成的影響
　　 利用慢病毒載體在PB CD34+細(xì)胞中表達(dá)外源MKL1，MKL1過表達(dá)的pCCL-MKL1組經(jīng)兩階段法誘導(dǎo)分化后CD41+巨核細(xì)胞的比例為61.49％，顯著高于pCCL對照組36.26％的分化比例(p＜0.05)。在DNA分布方面，pCCL-MKL1組相對pCCL組，2N倍體細(xì)胞比例由35.46％降低為23.86％(p

10、=0.013)，4N倍體細(xì)胞比例由30.52％降低為21.52％(p=0.001)，16N倍體細(xì)胞比例由9.15％增加為19.44％(p=0.014)，32N倍體細(xì)胞比例由2.39％增加為7.77％(p=0.010)，多倍體細(xì)胞(8N及以上倍體)總比例由31.10％增加為50.81％(p=0.001)。因此，MKL1外源表達(dá)促進(jìn)了PB CD34+細(xì)胞來源巨核細(xì)胞分化，增加了巨核細(xì)胞中多倍體細(xì)胞比例，促進(jìn)了巨核細(xì)胞的成熟。
　　

11、④MKL1功能缺陷對小鼠巨核細(xì)胞生成的影響
　　 構(gòu)建MKL1基因敲除小鼠，通過外周血和骨髓細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，MKL1功能缺陷小鼠外周血中的紅細(xì)胞、白細(xì)胞數(shù)量同野生型小鼠沒有差異，血小板數(shù)量為5.2×105/μL顯著低于野生型對照組8.2×105/μL(p＜0.001)，表現(xiàn)為血小板生成障礙；MKL1基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞總數(shù)、LSK細(xì)胞(Lin-Sca-1+c-Kit+cells，LSK cells)比例、pre-MegE(ery

12、thro-megakaryocytic progenitor cells，pre-MegE)細(xì)胞比例和巨核細(xì)胞集落形成能力與野生型小鼠沒有顯著差異；CD41+細(xì)胞比例顯著高于對照組(p＜0.0001)，CD41+c-kit+巨核系祖細(xì)胞比例也顯著高于野生型對照組(p＜0.01)；在DNA分布方面，MKL1基因敲除小鼠的骨髓CD41+細(xì)胞中，2N倍體細(xì)胞比例為32.15％顯著高于野生型小鼠14.97％的比例(p＜0.001)；同時8N和1

13、6N倍體細(xì)胞比例MKL1 KO組為18.20％和19.67％，顯著低于野生型對照組25.90％(p＜0.01)和30.65％(p＜0.05)的比例。因此，MKL1功能缺陷并未影響造血干/祖細(xì)胞到巨核細(xì)胞分化的早期過程，但阻滯了巨核系祖細(xì)胞或早期巨核細(xì)胞向多倍體巨核細(xì)胞的發(fā)育成熟過程，導(dǎo)致大量的未成熟的巨核細(xì)胞在骨髓中的堆積；而巨核細(xì)胞的成熟功能缺陷也直接導(dǎo)致了在外周血中血小板數(shù)量的減少。
　　 綜合以上結(jié)論我們推測，MKL1直接