Dickkopf-1蛋白與經(jīng)典Wnt信號(hào)通路失活在帕金森病模型中的作用研究.pdf

1、第一部分經(jīng)典Wnt信號(hào)通路失活在MPP+所致PC12細(xì)胞損失中的作用研究
　　目的:Wnt信號(hào)通路在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育及帕金森病多巴胺能神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在觀察經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的相關(guān)蛋白及其抑制劑Dkk1是否在MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中發(fā)生改變,并初步探討其可能機(jī)制。
　　方法:用不同濃度的MPP+作用于PC12細(xì)胞,MTT法檢測(cè)在不同時(shí)間細(xì)胞的存活率及Western Blot檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Dkk1

2、、β-catenin和p-Ser9-GSK-3β表達(dá)的變化情況。LiCl預(yù)處理1h后,再用MPP+作用PC12細(xì)胞,同時(shí)也檢測(cè)細(xì)胞的存活率及凋亡的情況,檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)Dkk1、β-catenin和p-Ser9-GSK-3β表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果:①不同濃度的MPP+對(duì)PC12細(xì)胞作用24h,細(xì)胞存活率沒(méi)有顯著變化,高濃度的MPP+對(duì)PC12細(xì)胞作用48h和72h后細(xì)胞存活率有顯著變化,并且在1000μM MPP+作用72h后,

3、細(xì)胞存活率降至最低45.0％,而1000μM MPP+作用48h和72h對(duì)細(xì)胞存活率的影響并沒(méi)有顯著性差異。②Western Blot結(jié)果顯示,在6-24h,MPP+誘導(dǎo)Dkk1的表達(dá)顯著增加,其表達(dá)高峰時(shí)間先于細(xì)胞的死亡時(shí)間,但是Dkk1的水平在48h恢復(fù)至正常。MPP+作用8h后,β-catenin的水平開(kāi)始有降低的趨勢(shì),在24h至48h其水平則顯著降低,p-Ser9-GSK-3β(GSK-3β的非活化形式)在MPP+作用6-48h

4、減少。③LiCl預(yù)處理可顯著增加PC12細(xì)胞中β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表達(dá)。④LiCl預(yù)處理減輕MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞存活率的減少,Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)及TUNEL法顯示MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡率的增加也可被LiCl(1mM)減少。
　　結(jié)論:經(jīng)典Wnt信號(hào)通路蛋白和其抑制劑Dkk1可能參與了MPP+對(duì) PC12細(xì)胞的增殖抑制作用,Dkk1可能通過(guò)抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路蛋白

5、而發(fā)揮作用。
　　第二部分Dickkopf-1在MPP+所致PC12細(xì)胞損傷中的作用
　　目的:第一部分實(shí)驗(yàn)表明Dkk1在MPP+致PC12細(xì)胞損傷模型中的誘導(dǎo)表達(dá)先于細(xì)胞死亡,本實(shí)驗(yàn)旨在探討Dkk1在MPP+致PC12細(xì)胞損傷模型中的機(jī)制。
　　方法:通過(guò)對(duì)外源性的給予rhDkk1聯(lián)合MPP+處理PC12細(xì)胞48h后,檢測(cè)細(xì)胞存活率及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況。通過(guò)siRNA技術(shù)下調(diào)Dkk1在PC12細(xì)胞的

6、表達(dá),觀察細(xì)胞凋亡情況及Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化情況。
　　結(jié)果:①rhDkk1(100 ng/ml)與MPP+聯(lián)合作用細(xì)胞48h后檢測(cè)細(xì)胞存活率,結(jié)果顯示:rhDkk1加重MPP+對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用,而LiCl預(yù)處理1h并不能顯著改善兩者聯(lián)合應(yīng)用引起的細(xì)胞損傷作用。②rhDkk1促進(jìn)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中TH的減少。與MPP+單獨(dú)處理組相比,兩者聯(lián)合應(yīng)用β-catenin減少的更多,但p-Ser9-GSK-3

7、β輕微減少。③Dkk1-siRNA可以顯著減輕MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡。④Dkk1-siRNA有效的增加β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的表達(dá),同時(shí)也顯著提高TH的水平。
　　結(jié)論:Dkk1參與了MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能與抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路相關(guān)。
　　第三部分Dickkopf-1在6-OHDA損傷大鼠的帕金森病模型中的作用
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在觀察Dkk1在6-OHDA損傷

8、大鼠的帕金森病模型中的作用。
　　方法:通過(guò)腦立體定位儀經(jīng)MFB給予6-OHDA損傷大鼠,制備帕金森病模型。另有LiCl預(yù)處理7d后再給予6-OHDA損傷大鼠組,及通過(guò)黑質(zhì)給予rhDkk1與MFB給予6-OHDA聯(lián)合損傷大鼠組。術(shù)后35d多聚甲醛灌注免疫組化檢測(cè)各組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷情況,并取大鼠腹側(cè)中腦Western Blot檢測(cè)TH、Dkk1及β-catenin、p-Ser9-GSK-3β的變化情況。
　　結(jié)果:①

9、6-OHDA損傷組TH陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量明顯減少,LiCl預(yù)處理組的TH陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量則明顯增加;rhDkk1與6-OHDA聯(lián)合損傷組,與6-OHDA單獨(dú)損傷組相比,TH陽(yáng)性的神經(jīng)元數(shù)量則降低的更明顯。②Dkk1在6-OHDA損傷的大鼠術(shù)后35d腹側(cè)中腦的表達(dá)明顯增加。③經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的抑制在6-OHDA損傷的大鼠腹側(cè)中腦中也被檢測(cè)到,包括β-catenin和p-Ser9-GSK-3β的降低,而兩者表達(dá)水平均可被LiCl升高;rhD