卵巢癌肝脾轉(zhuǎn)移動物模型的建立及轉(zhuǎn)染CD40L基因抗卵巢癌肝轉(zhuǎn)移作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：卵巢癌是一種常見的，死亡率極高的婦科惡性腫瘤，目前主要采用手術(shù)、放療、化療相結(jié)合的治療方法，雖治療手段有了較大進(jìn)步，但療效并不樂觀。惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫功能低下有關(guān)，目前免疫基因治療越來越受到重視℃D40配體(CD40L)是一種免疫調(diào)節(jié)分子，CD40L與CD40結(jié)合能有效刺激T細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)其特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，還可誘導(dǎo)T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。本課題旨在建立小鼠肝脾轉(zhuǎn)移動物模型的基礎(chǔ)上，探討轉(zhuǎn)染

2、CD40L基因的卵巢癌細(xì)胞株OVHM(CD40L-OVHM)脾臟接種后體內(nèi)抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制，為CD40L的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1用MTT法測定CD40L-OVHM細(xì)胞、OVHM細(xì)胞和空載體DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞的生長曲線，應(yīng)用倒置顯微鏡觀察三種細(xì)胞的形態(tài)。 2用流式檢測儀檢測CD40L在CD40L-OVHM細(xì)胞和OVHM細(xì)胞的表達(dá)情況。 3用HE染色法驗(yàn)證經(jīng)小鼠脾內(nèi)接種OVHM

3、細(xì)胞建立肝轉(zhuǎn)移模型的可行性。 4經(jīng)小鼠脾臟內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞建立肝轉(zhuǎn)移模型分為四組：OVHM細(xì)胞組、空載體DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組、CD40L-OVHM細(xì)胞組及注射PBS液組。于小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞后第10天用流式細(xì)胞儀分析不同組脾細(xì)胞CD11c分子的表達(dá)情況來反映樹突狀細(xì)胞(DC)的數(shù)量。于小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞后第10天用MTT法檢測不同組脾臟殺傷性T細(xì)胞(CTL)的殺傷活性。于小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞后第14天用EL

4、ISA法檢測不同組小鼠外周血血清中細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4、IL-10和IL-12)的含量。于小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞后第14天稱量小鼠肝臟和脾臟的重量及觀察肝臟轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)的情況。最后每組余下10只小鼠用于觀察生存期。 結(jié)果： 1鏡下觀察OVHM細(xì)胞、CD40L-OVHM細(xì)胞和DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞三種細(xì)胞形態(tài)無明顯區(qū)別，測定三種細(xì)胞的生長增殖情況無明顯差異。 2.CD40L-OVH

5、M細(xì)胞表面大量表達(dá)CD40L分子，而OVHM細(xì)胞未見CD40L表達(dá)。 3小鼠脾臟內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞OVHM細(xì)胞后第14天脾臟接種局部出現(xiàn)原發(fā)腫瘤，肝臟表面可見大量轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)，病理學(xué)證實(shí)小鼠肝臟和脾臟的腫瘤結(jié)節(jié)的病理學(xué)形態(tài)結(jié)構(gòu)相似，可見肝脾轉(zhuǎn)移動物模型建立成功。 4接種OVHM細(xì)胞、DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞和CD40L-OVHM細(xì)胞后10天的小鼠脾細(xì)胞中CD11c陽性細(xì)胞率均明顯高于PBS對照組(P＜0.05)，

6、CD40L-OVHM細(xì)胞組小鼠的脾細(xì)胞中CD11c陽性細(xì)胞率(20.30±1.23％)與DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組和OVHM細(xì)胞組小鼠脾細(xì)胞相比較(10.69±0.89％和10.56±0.85％)有顯著性提高(P＜0.05)。 5不同組小鼠的脾臟細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)殺傷活性檢測結(jié)果顯示：CD40L-OVHM細(xì)胞組、OVHM細(xì)胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組的小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷率均高于PBS組(P

7、＜0.05)，CD40L-OVHM組對OVHM細(xì)胞的殺傷能力明顯高于OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組(P＜0.05)，OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組間無顯著性差異(P＞0.05)。 6 CD40L-OVHM組血清TNF-α、IL-12和IFN-γ,濃度明顯高于DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組和OVHM細(xì)胞組(P＜0.05)：CD40L-OVHM組血清IL-4和IL-10濃度明顯低于OVH

8、M組和DNA-pMKITneo-OVHM組(P＜0.05)。OVHM組和DNA-pMKITneo-OVHM組間血清TNF-α、IL-12、IFN-γ、IL-4、IL-10濃度均無明顯差異(P＞0.05)。 7小鼠脾內(nèi)接種腫瘤細(xì)胞發(fā)生肝轉(zhuǎn)移和脾臟原發(fā)瘤情況：小鼠脾臟接種腫瘤細(xì)胞后第14天，DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組和OVHM細(xì)胞組小鼠均出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，脾臟均有原發(fā)瘤，肝臟平均重量分別為3.07±0.19g，3.10±0.

9、21g；脾臟平均重量分別為1.25±0.14g，1.23±0.16g，兩組之間無顯著性差異。CD40L-OVHM細(xì)胞組小鼠中有3只小鼠發(fā)生了肝轉(zhuǎn)移(3/10)，肝臟平均重量為1.45±0.14g；所有接種CD40L-OVHM細(xì)胞的小鼠脾臟均出現(xiàn)原發(fā)瘤，脾臟平均重量為0.58±0.10g。CD40L-OVHM細(xì)胞組小鼠的肝臟和脾臟重量均輕于OVHM細(xì)胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組肝脾的重量(P＜0.05)，但與PBS對照組

10、相比，OVHM細(xì)胞組、DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組和CD40L-OVHM細(xì)胞組的小鼠肝臟和脾臟重量均明顯增加(P＜0.05)。 8對照組PBS組小鼠在試驗(yàn)期間無一死亡，OVHM細(xì)胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組的小鼠在試驗(yàn)觀察期(65天)全部死亡，平均生存期分別為17±1天和18±1天；CD40L-OVHM細(xì)胞組的小鼠到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)有6只死亡，其余4只在結(jié)束實(shí)驗(yàn)時(shí)仍然存活，平均生存期為58±3天，明顯長于

11、OVHM細(xì)胞組和DNA-pMKITneo-OVHM細(xì)胞組(P＜0.05)。 結(jié)論： 1.通過建立小鼠肝脾轉(zhuǎn)移動物模型證實(shí)表達(dá)CD40L的OVHM細(xì)胞(CD40L-OVHM)的體內(nèi)抑瘤作用明顯。 2.表達(dá)CD40L的OVHM細(xì)胞(CD40L-OVHM)能夠有效地促進(jìn)脾臟DC的增殖和分化，增強(qiáng)脾臟細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的特異性殺傷活性，增強(qiáng)機(jī)體局部抗腫瘤作用。 3.表達(dá)CD40L的OVHM細(xì)胞(CD40L-