細(xì)粒棘球蚴重組抗原EF-1基因的克隆、表達(dá)、蛋白特性分析及免疫原性鑒定.pdf

1、目的：克隆、表達(dá)細(xì)粒棘球蚴(Echinococcus granulosus，Eg)延伸因子1（elongation factor 1, EF-1）基因，分析重組蛋白特性并對其免疫原性進(jìn)行鑒定，預(yù)測其可能的抗原表位，為篩選人包蟲病疫苗的候選抗原分子的研究提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：（1）利用生物信息學(xué)方法通過互聯(lián)網(wǎng)NCBI/GenBank檢索到Eg.EF-1基因序列，根據(jù)該序列設(shè)計(jì)一對PCR引物；以原頭蚴為材料提取細(xì)粒棘球蚴

2、總RNA，利用RT-PCR擴(kuò)增目的基因，構(gòu)建Eg.EF-1/Pgem-T/JM109基因工程菌株。（2）對克隆基因進(jìn)行測序并利用生物信息學(xué)方法進(jìn)行核酸序列同源性分析，進(jìn)一步根據(jù)克隆基因開放閱讀框（ORF）推測的編碼氨基酸序列對蛋白質(zhì)組成、二、三級結(jié)構(gòu)、特性進(jìn)行分析并預(yù)測其可能的抗原表位。（3）構(gòu)建重組Eg.EF-1/Pgex-6P-1/BL21原核表達(dá)菌株，并誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白GST/EF-1，親和層析法純化重組Eg.EF-1，SDS-P

3、AGE對重組蛋白進(jìn)行鑒定；用天然包蟲囊液抗原免疫兔所制備的多克隆抗血清對重組Eg.EF-1進(jìn)行Western blot免疫學(xué)鑒定，再將重組GST/EF-1和Eg.EF-1分別與免疫佐劑一起制成抗原免疫實(shí)驗(yàn)動物昆明小鼠，并通過Western blot和ELISA方法鑒定重組抗原的免疫學(xué)特性。 結(jié)果：（1）克隆出Eg.EF-1基因，并成功構(gòu)建了EF-1/Pgem-T/JM109菌株。（2）生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示該基因的ORF為69

4、3bp，它與檢索的Eg.EF-1基因序列有99％同源性，推測該克隆基因的ORF編碼230個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)可能的抗原表位有20-26SATEQKG、50-56SWNERME、176-185LWGTSKLVPL、199-205VENDKVG、217-229ELEDYVQSVDVAS5個(gè)肽段。（3）成功的構(gòu)建了具有高效表達(dá)能力的Eg.EF-1/Pgex-6P-1/E.coli BL21菌株。SDS-PAGE分析結(jié)果證實(shí)了融合蛋白

5、分子量約為57kDa，重組Eg. EF-1的分子量約為31kDa；Western blot結(jié)果顯示，融合蛋白，目的蛋白均能被包蟲囊液抗原免疫兔的多克隆抗血清所識別；免疫小鼠的抗血清均能有效識別重組融合蛋白和Eg.EF-1，ELISA顯示試驗(yàn)組抗血清中IgG抗體滴度與對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。 結(jié)論：成功構(gòu)建了基因工程菌株EF-1/Pgem-T/JM109；重組蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果確定了一些具體的抗原表位