胚胎肝細(xì)胞分化因子—10（ELDF-10）的克隆表達(dá)及功能的初步研究.pdf

1、　　為了研究ELDF10基因在DS19細(xì)胞中的功能。首先，將ELDF10的編碼區(qū)克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-N1中，表達(dá)融合蛋白。利用Lipofectin法轉(zhuǎn)染到MEL-DS19中，使DS19細(xì)胞過表達(dá)ELDF10蛋白，觀察是否對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖和分化有影響，初步探討ELDF10基因在DSλ9細(xì)胞中的功能?！　∞D(zhuǎn)染的重組真核表達(dá)載體和空載體，經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定表達(dá)抗性克隆?！　∮肦T-PCR方法在mRNA水平檢測(cè)轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒、轉(zhuǎn)

2、染空載體和正常腫瘤細(xì)胞中ELDF10基因的表達(dá)，以在組織中恒定表達(dá)的GAPDH為對(duì)照，結(jié)果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞中ELDF10mRNA表達(dá)量增加?！　y(cè)定三種細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，發(fā)現(xiàn)在這三種細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯低于轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和正常的腫瘤細(xì)胞，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的生長(zhǎng)速度比正常DS19細(xì)胞略有增加，說明空載體在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)GFP蛋白對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，但與GFP融合表達(dá)的重組蛋白對(duì)腫瘤細(xì)胞有促進(jìn)增殖作用。　　流式細(xì)胞儀檢測(cè)

3、細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞較轉(zhuǎn)染空載體和正常細(xì)胞G1期細(xì)胞減少，G2期細(xì)胞增多，表明ELDFi0-GFP融合蛋白可以減少細(xì)胞增殖周期時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞增殖?！　÷?lián)苯胺染色陽性是細(xì)胞分化成熟的一個(gè)標(biāo)志，對(duì)三種細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)苯胺染色，觀察有無血紅蛋白在胞漿中表達(dá)，結(jié)果均為陰性。說明ELDF10-GFP融合蛋白可能沒有誘導(dǎo)細(xì)胞分化作用。　　RT-PCR在mRNA水平檢測(cè)β珠蛋白的表達(dá)，以GAPDH為對(duì)照，結(jié)果轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒細(xì)胞中β珠蛋白的表達(dá)