肺炎衣原體Hsp10基因克隆與表達及誘生炎癥因子和細胞凋亡作用的研究.pdf

1、目的:PCR擴增出肺炎衣原體(Cpn)熱休克蛋白10(Hsp10)基因,構建重組質粒pQE30/Hsp10,在大腸桿菌(E.coli)中進行誘導表達,純化獲得重組融合蛋白rHsp10。研究該重組蛋白在體外誘導小鼠巨噬細胞表達并產(chǎn)生前炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的水平及誘導細胞凋亡作用,為進一步探索Cpn感染致病的分子機制提供試驗依據(jù)。
　　方法:針對Cpn Hsp10基因設計引物,以Cpn AR39株基因組DNA為模板, PC

2、R擴增目的基因片段,將其插入pUCm-T載體,通過藍白斑初篩,酶切分析、PCR及測序鑒定篩選陽性重組體;將Hsp10基因亞克隆至pQE30表達載體,構建重組質粒pQE30/ Hsp10,然后轉化至宿主菌M15中進行誘導表達,利用SDS-PAGE和Western-Blot進行分析和鑒定表達產(chǎn)物,Ni-NTA親和層析柱純化重組蛋白rHsp10。用不同濃度的rHsp10刺激小鼠巨噬細胞RAW264.7,ELISA檢測經(jīng)刺激后的RAW264.7

3、細胞產(chǎn)生的TNF-α和IL-6水平;以RT-PCR方法分析TNF-α和IL-6 mRNA的表達。以MTT法檢測經(jīng)rHsp10處理后RAW264.7細胞的增生或抑制作用,用Hoechst33258熒光染色、DNA片段化分析、細胞凋亡試劑盒檢測經(jīng)rHsp10處理后RAW264.7細胞的凋亡情況。
　　結果:PCR成功擴增出Cpn Hsp10基因片段(309bp),構建了重組質粒pQE30/Hsp10,并在M15菌中高效表達出Mr約為1

4、5kDa的Hsp10重組融合蛋白,超聲裂解后 SDS-PAGE分析目的蛋白在菌體細胞內(nèi)以可溶性形式表達,經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化獲得純度在95％以上的rHsp10。rHsp10能誘導RAW264.7細胞表達TNF-α和IL-6的mRNA,并以時間、劑量依賴方式刺激細胞分泌前炎癥細胞因子TNF-α和IL-6,當rHsp10的濃度為6μg/mL時產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量最多,分別為12.67±0.66ng/mL和3.23±0.28n

5、g/mL;當rHsp10刺激RAW264.7細胞36h時產(chǎn)生的TNF-α和IL-6量則達到高峰。另外,rHsp10以劑量依賴方式抑制RAW264.7細胞增殖。當20μg/mL rHsp10處理RAW264.7細胞24h后,形態(tài)學上,細胞表現(xiàn)為皺縮、核碎裂、細胞起泡及凋亡小體等凋亡特征;當rHsp10刺激RAW264.7細胞6h后,即可誘導其發(fā)生早期凋亡,12h后出現(xiàn)晚期凋亡;當5μg/mL rHsp10處理RAW264.7細胞48h后,