衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的分段克隆表達(dá)及其與沙眼衣原體相互作用的功能區(qū)域初探.pdf

1、沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,CT)是一種較常見性傳播疾病(Sexually transmitted disease,STD)病原體。沙眼衣原體感染后，患者會出現(xiàn)一系列的臨床癥狀，例如宮頸炎、陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎、非淋菌性尿道炎、前列腺炎、Reiter綜合征、性病性淋巴肉芽腫等[1,2]。若感染沙眼衣原體后不積極治療，則可能導(dǎo)致女性患者出現(xiàn)自然流產(chǎn)、胎膜早破、異位妊娠、早產(chǎn)和輸卵管性不孕等嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生

2、。而且長期、反復(fù)的沙眼衣原體感染可能增加女性患者宮頸鱗狀上皮細(xì)胞癌、艾滋病感染的危險(xiǎn)性[3]。2001年，據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）報(bào)道，世界上每年有新增沙眼衣原體感染病例約9200萬例，其中有70％女性患者及50%男性患者為無癥狀感染者，而實(shí)際的感染者遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出此統(tǒng)計(jì)數(shù)字[4]。美國疾病控制與預(yù)防中心（CDC）的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示：從2007年-2012年，在青中年人群中沙眼衣原體的感染率達(dá)到1.7%[5]。沙眼衣原體感染已經(jīng)成為美國最為常見的

3、性傳播疾病，發(fā)病率較高，每年新增感染者大于140萬[6]。并且，女性患者發(fā)病率高于男性患者[7]。泌尿生殖道沙眼衣原體感染已經(jīng)成為最常見的性傳播疾病之一。泌尿生殖道沙眼衣原體感染嚴(yán)重的危害了人類的健康，如何更好的治療該疾病，已經(jīng)成為了較為重要的公共衛(wèi)生問題。近些年來，由于抗生素的濫用，耐藥菌感染率不斷增加，使抗生素在細(xì)菌感染性疾病中的應(yīng)用遇到了瓶頸。臨床中，衣原體的治療也遇到了同樣的難題。而衣原體噬菌體對衣原體的天然殺傷作用為衣原體感染

4、性疾病的控制及治療提供了良好的發(fā)展前景，可以利用衣原體噬菌體作為一種生物制劑來治療沙眼衣原體的感染。但在此之前，我們需要進(jìn)一步的確定衣原體噬菌體與衣原體的相互作用區(qū)域，以便更好的了解兩者間的相互作用機(jī)制。
　　衣原體噬菌體具有三種主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括Vp1，Vp2和Vp3。Vp1是主要的并且是最大的衣原體噬菌體衣殼蛋白，一些研究顯示 Vp1可能是衣原體噬菌體識別粘附宿主的功能區(qū)域[8,9]。對Vp1氨基酸序列的分析顯示在其氨基酸序列

5、216-299和462-467間存在兩個(gè)明顯的不同區(qū)域[8]。其中較大的被稱為IN5環(huán)，研究者預(yù)測它暴露在病毒表面并在其表面形成蕈樣突起。較小的區(qū)域被稱為INS，也考慮是暴露在病毒表面，而且預(yù)測其與IN5環(huán)位置極為貼近并相互作用[9]。在衣原體噬菌體 Vp1序列的差異主要是指區(qū)域： IN5和 INS。這表明 IN5和 INS區(qū)域參與受體的識別。硅片分析證實(shí)兩個(gè)區(qū)域彼此相鄰，這表明它們在決定不同衣原體噬菌體的宿主范圍和組織嗜性中起主要作用

6、[10]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)衣殼蛋白Vp1對沙眼衣原體具有抑制其生長的作用[11]，而且作用效果顯著。本研究通過進(jìn)一步縮小衣原體衣殼蛋白 Vp1的表達(dá)片段，來尋找衣原體噬菌體與衣原體相互作用的功能區(qū)域。
　　[目的]將衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1分段克隆表達(dá)，初步確定衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1與沙眼衣原體相互作用的功能區(qū)域。
　　[方法]通過I-TASSER、PredictProtien等蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)分

7、析網(wǎng)站對衣原體噬菌體phiCPG1衣殼蛋白Vp1的空間結(jié)構(gòu)及其與沙眼衣原體相互作用的功能位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測分析，根據(jù)預(yù)測結(jié)果以及研究背景，將衣殼蛋白 Vp1分為不同的部分進(jìn)行表達(dá)，通過 TA克隆技術(shù)克隆表達(dá)目的蛋白，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western-blot免疫印跡技術(shù)對目的蛋白進(jìn)行鑒定，再通過氯化鉀膠回收法對目的蛋白進(jìn)行純化，并進(jìn)行蛋白定量。將目的蛋白分別作用于沙眼衣原體 E型標(biāo)準(zhǔn)株，觀察并分析衣殼蛋白Vp1全長及兩個(gè)蛋白片段分別對沙

8、眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株的抑制作用，并進(jìn)行比較分析。
　　[結(jié)果]根據(jù)預(yù)測結(jié)果及相關(guān)背景資料將衣殼蛋白 Vp1分為 Vp11-189和Vp1190-502兩部分，目的蛋白Vp11-189和Vp1190-502的基因序列長度分別為567bp和939bp，通過 SDS-PAGE以及 Western-blot鑒定結(jié)果顯示蛋白 Vp11-189和Vp1190-502的相對分子質(zhì)量分別為20KD和35KD，并且獲得了純化的蛋白Vp11-189和V

9、p1190-502。同時(shí)，體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示蛋白Vp11-189、Vp1190-502及Vp1對沙眼衣原體均有抑制作用，且抑制率分別為43.95%、81.74%和78.02%。
　　[結(jié)論]成功將phiCPG1衣殼蛋白Vp1分為Vp11-189、Vp1190-502兩部分進(jìn)行表達(dá)，通過體外干預(yù)實(shí)驗(yàn)證明，蛋白Vp1190-502與衣殼蛋白Vp1對沙眼衣原體E型標(biāo)準(zhǔn)株具有相似的抑制作用，并且作用效果顯著。蛋白 Vp1的190-502