登革出血熱-登革休克綜合癥的免疫病理機制研究.pdf

1、研究背景：
　　 登革病毒(dengue virus,DENV)為黃病毒屬單正股RNA病毒,分1、2、3、4等四個血清型。登革病毒疾病是一類由DENV引起的,主要由蚊媒傳播的,嚴(yán)重危害人類健康的病毒性傳染病。近年來DENV感染在全球范圍,尤其在熱帶、亞熱帶地區(qū)呈逐年上升趨勢,流行區(qū)域正在擴大,已成為世界上危害較大的一種蟲媒病毒病,是全球重要的公共衛(wèi)生問題。
　　 DENV感染所致疾病包括從較輕的登革熱(dengue fe

2、ver,DF)到嚴(yán)重致死性的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever,DHF),以及登革休克綜合癥(dengueshock syndrome,DSS)。血漿滲漏和出血癥狀是DHF/DSS重要的臨床特征,DHF/DSS的主要病理生理改變包括:(1)血管通透性增加,患者出現(xiàn)白細(xì)胞數(shù)量和功能改變、紅細(xì)胞壓積增加、血小板減少及凝血障礙。(2)血漿滲漏是DHF的主要臨床表現(xiàn),一般出現(xiàn)在退熱期；血漿大量進(jìn)入腔隙中,血容量減少、血

3、液濃縮、血壓降低,最終導(dǎo)致休克,引發(fā)DSS。有關(guān)DHF/DSS的致病機制目前仍不清楚。
　　 NS1是DENV重要的非結(jié)構(gòu)蛋白,在細(xì)胞感染過程中,以可溶性形式存在于感染細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面。NS1是一種高度保守的糖蛋白,是病毒生存所必需的,但是其確切功能還不清楚。以往研究表明NS1可能與病毒感染宿主的血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞等具有相似的抗原決定簇,登革病毒可能通過分子模擬機制導(dǎo)致疾病的發(fā)生；然而NS1具體的致病機制目前并未闡明。

4、　　 研究目的：
　　 登革病毒致感染宿主發(fā)生DHF/DSS的免疫病理機制目前仍不清楚,以往研究表明NS1可能在此免疫病理過程中發(fā)揮重要作用,但其具體機制仍有待研究。本研究構(gòu)建抗NS1抗體和NS1特異性T細(xì)胞,從體液免疫和細(xì)胞免疫兩個方面系統(tǒng)地探討NS1致病毒感染宿主血小板減少和血管滲漏的免疫病理機制,為進(jìn)一步揭示DHF/DSS的病理機制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：
　　 一、抗NS1抗體介導(dǎo)的免疫病理作用研究

5、
　　 1.DENV2 NS1的表達(dá)和純化
　　 采用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)DENV2 NS1,6×His標(biāo)簽樹脂過濾柱純化NS1,免疫印跡法鑒定NS1。
　　 2.抗NS1抗體制備
　　 NS1加弗氏完全佐劑多點注射免疫BAL B/c小鼠,然后用NS1加弗氏不完全佐劑多次腹腔注射加強免疫以獲得抗NS1多克隆抗體,ELISA法檢測其抗體效價。
　　 3.抗NS抗體的體外免疫病理作用研究
　　

6、 3.1流式細(xì)胞術(shù)檢測抗NS1抗體與血小板交叉反應(yīng)性,免疫熒光法檢測抗NS1抗體與血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human microvascular endothelial cell1,HMEC-1)交叉反應(yīng)性。
　　 3.2抗NS1抗體與HMEC-1細(xì)胞共培養(yǎng),加入BAL B/c小鼠新鮮血清,ELISA法檢測培養(yǎng)上清中C3a、C4a、C5a、sC5b-9等補體活性成分含量。
　　 3.3 HMEC-1細(xì)胞爬片培養(yǎng),加入抗NS1抗體和

7、BAL B/c小鼠新鮮血清,免疫熒光法檢測膜攻擊復(fù)合體(membrane attack complex,MAC)在HMEC-1細(xì)胞爬片上的定位。
　　 4.抗NS抗體的體內(nèi)疫病理作用研究
　　 4.1尾靜脈注射抗NS1抗體過繼免疫BAL B/c小鼠。
　　 4.2顯微鏡計數(shù)過繼免疫小鼠外周血血小板數(shù)量,HE染色法觀察其血管組織結(jié)構(gòu)損傷及炎性細(xì)胞浸潤狀況。
　　 4.3免疫組織化學(xué)法檢測抗NS1抗體與過繼免

8、疫小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞交叉反應(yīng)性。
　　 4.4 ELISA法檢測過繼免疫小鼠外周血C3a、C4a、C5a、sC5b-9等補體活性成分含量。
　　 二、NS1特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理作用研究
　　 1.NS1特異性T細(xì)胞系的建立
　　 1.1采用間歇循環(huán)刺激和有限稀釋法建立NS1蛋白特異性T細(xì)胞系。
　　 1.2 MTT法分析T細(xì)胞系的抗原特異性。
　　 1.3流式細(xì)胞術(shù)分析T細(xì)胞系的表型特

9、征。
　　 2.NS1特異性T細(xì)胞的體外免疫病理作用研究
　　 2.1 NS1刺激培養(yǎng)NS1特異性T細(xì)胞,ELISA法檢測培養(yǎng)上清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子含量。
　　 2.2 NS1特異性T細(xì)胞與HMEC-1細(xì)胞共培養(yǎng),免疫組織化學(xué)法分析HMEC—1細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Fas、FADD、Caspase3、Caspase8的表達(dá)水平,流式細(xì)胞術(shù)檢測HMEC-1細(xì)胞凋亡率。

10、>　　 3.NS1特異性T細(xì)胞的體內(nèi)疫病理作用研究
　　 3.1尾靜脈注射NS1特異性T細(xì)胞過繼免疫BAL B/c小鼠。
　　 3.2顯微鏡計數(shù)過繼免疫小鼠外周血血小板數(shù)量,HE染色法觀察其血管組織結(jié)構(gòu)損傷及炎性細(xì)胞浸潤狀況。
　　 3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測過繼免疫小鼠外周血血小板凋亡蛋白Fas的表達(dá),比色法測定血管組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase8的活性。
　　 3.4 ELISA法測定過

11、繼免疫小鼠外周血Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)、Th2型細(xì)胞因子(IL-4)、免疫下調(diào)因子(IL-10)和腫瘤壞死因子(TNF-α)含量。
　　 研究結(jié)果：
　　 一、抗NS1抗體介導(dǎo)的免疫病理作用研究
　　 1.DENV2 NS1的表達(dá)和純化
　　 本研究獲得了純化的DENV2 NS1,可用于后續(xù)試驗。
　　 2.抗NS1抗體制備
　　 NS1加弗氏佐劑免疫BAL B/c小鼠,獲得了高效

12、價的抗NS1多克隆抗體。
　　 3.抗NS抗體的體外免疫病理作用研究
　　 3.1抗NS1抗體與血小板和血管內(nèi)皮細(xì)胞有交叉反應(yīng)性。
　　 3.2抗NS1抗體與血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMEC-1)共培養(yǎng)體系可有效激活補體系統(tǒng),產(chǎn)生過敏毒素C3a、C4a、C5a,形成MAC并定位在HMEC-1細(xì)胞膜上。
　　 4.抗NS1抗體的體內(nèi)疫病理作用研究
　　 4.1抗NS1抗體過繼免疫BAL B/c小鼠,可導(dǎo)致免疫

13、小鼠外周血血小板數(shù)量減少,可介導(dǎo)炎性細(xì)胞在血管組織浸潤并損傷血管組織結(jié)構(gòu),造成血管滲漏。
　　 4.2抗NS1抗體與過繼免疫BAL B/c小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞有交叉反應(yīng)性。
　　 4.3抗NS1抗體過繼免疫BAL B/c小鼠,可有效激活補體系統(tǒng),產(chǎn)生過敏毒素C3a、C4a、C5a,以及可溶性MAC。
　　 二、NS1特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫病理作用研究
　　 1.NS1特異性T細(xì)胞系的建立
　　 本研究

14、獲得了NS1特異性T細(xì)胞系,主要為CD4+T細(xì)胞,即輔助/誘導(dǎo)性T細(xì)胞,所有細(xì)胞均高表達(dá)死亡配體分子FasL。
　　 2.NS1特異性T細(xì)胞的體外免疫病理作用研究
　　 2.1 NS1特異性T細(xì)胞在NS1蛋白刺激下,可分泌大量的IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ和TNF-α等細(xì)胞因子。
　　 2.2 NS1特異性T細(xì)胞可導(dǎo)致共培養(yǎng)的HMEC-1細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Fas、FADD、Caspase3、C

15、aspase8表達(dá)水平增加。
　　 3.NS1特異性T細(xì)胞的體內(nèi)疫病理作用研究
　　 3.1 NS1特異性T細(xì)胞過繼免疫BAL B/c小鼠,可導(dǎo)致免疫小鼠外周血血小板數(shù)量減少,可介導(dǎo)炎性細(xì)胞在血管組織浸潤并損傷血管組織結(jié)構(gòu),造成血管滲漏。
　　 3.2 NS1特異性T細(xì)胞過繼免疫BAL B/c小鼠外周血血小板凋亡蛋白Fas表達(dá)增加,血管組織凋亡相關(guān)蛋白Caspase3、Caspase8的活性增加。
　　

16、3.3 NS1特異性T細(xì)胞過繼免疫BAL B/c小鼠外周血Th1型細(xì)胞因子(IFN-γ)和Th2型細(xì)胞因子含量增加(IL-4),免疫下調(diào)因子(IL—10)含量降低,腫瘤壞死因子(TNF-α)含量增加。
　　 研究結(jié)論：
　　 DENV2 NS1可誘導(dǎo)抗NS1抗體產(chǎn)生,這種抗NS1抗體可通過分子模擬機制與病毒感染宿主的血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板非特異性結(jié)合,有效激活補體系統(tǒng),生成大量毒性補體成分和攻膜復(fù)合體,直接和(或)間接作用