Tregs調(diào)控瘧疾保護性免疫應(yīng)答和免疫病理效應(yīng)機制的研究.pdf

1、實驗?zāi)康模?瘧疾是瘧原蟲通過媒介昆蟲蚊傳播的人類最為嚴重的寄生原蟲感染性疾病?！禢ature》公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，世界上100多個國家為瘧疾流行區(qū)，約22億人口受到瘧疾的威脅，每年有300～500萬瘧疾臨床病例，病死人數(shù)高達110～270萬。為此，2003年WHO將瘧疾作為優(yōu)先重點防治的感染性疾病。在中國，盡管在控制瘧疾流行、減少危害程度方面取得了顯著成效，但由于耐藥性原蟲和耐殺蟲劑性蚊的普遍出現(xiàn)，以及近年來流動人口劇增、氣候變

2、暖和生態(tài)環(huán)境變化等因素，疫情狀況依然十分嚴峻。據(jù)最新統(tǒng)計顯示，2000年以來我國瘧疾發(fā)病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢，現(xiàn)有21個省(直轄市、自治區(qū))的907個縣有瘧疾病例報告，受瘧疾威脅人口高達5.5億。因此，有效的瘧疾疫苗和抗瘧新藥的研制開發(fā)已經(jīng)成為當今世界迫切需要解決的重點課題，而瘧原蟲感染宿主機體應(yīng)答的免疫學、分子生物學等綜合基礎(chǔ)研究是其重要前提。 瘧疾與其他大多數(shù)感染性疾病一樣，需要通過免疫效應(yīng)機制對其控制和消除。同時，由于過強

3、的炎癥反應(yīng)引起腦瘧等免疫病理損傷也是這一疾病的突出特征。關(guān)于紅內(nèi)期瘧原蟲感染的免疫機制，無論鼠瘧模型和人體試驗研究結(jié)果均已證實：①CD4+T細胞在抵抗紅內(nèi)期瘧原蟲感染過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。在感染早期，Th1型細胞經(jīng)DC分泌的IL-12誘導活化，產(chǎn)生以IFN—γ為主的炎癥性細胞因子，遏制瘧原蟲的爆發(fā)性增殖；隨之，由Th2型細胞輔助B細胞產(chǎn)生特異性抗體，能夠有效地清除瘧原蟲，防止復發(fā)和再燃。由此表明：抗瘧保護性免疫有賴于Th1和Th2型

4、免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡。②Th1/Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生時相和效應(yīng)強度明顯地影響著最終的感染結(jié)局。各種數(shù)據(jù)顯示，致死型腦瘧等嚴重并發(fā)癥的出現(xiàn)與機體過強的Th1型炎癥應(yīng)答密切相關(guān)。由此提示：維持前炎癥細胞因子和抗炎癥細胞因子之間的動態(tài)平衡，控制炎癥性細胞因子產(chǎn)生的時間和強度對瘧疾感染甚為關(guān)鍵。打破免疫應(yīng)答之間的平衡或擾亂免疫應(yīng)答的時間進程，均可能導致慢性感染或者病情加重。換言之，在決定瘧疾感染最終結(jié)局方面，調(diào)控瘧疾感染的免疫應(yīng)答與誘

5、導有效的抗瘧免疫同樣重要。然而，目前關(guān)于保護性和病理性免疫應(yīng)答動態(tài)平衡的調(diào)控機制尚未闡明。 CD4+T細胞亞類CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(Tregs)是一類具有獨特免疫調(diào)節(jié)功能的細胞群，體內(nèi)、外試驗顯示，Tregs具有廣泛的免疫抑制性，通過表面膜分子與其它細胞直接接觸、或分泌抑制性細胞因子IL-10和TGF-β兩種方式，可抑制體內(nèi)天然CD4+T和CD8+T細胞等多種細胞的活化和增殖。目前，對Tregs的研究主要集中于自身免

6、疫性疾病、抗移植和抗腫瘤免疫等方面，而在瘧疾等感染性疾病中作用的研究才剛剛起步，特別是關(guān)于Tregs對Th應(yīng)答效應(yīng)和Th1/Th2極化機制方面的研究尚未深入開展。有限的研究結(jié)果顯示，在感染致死型伯氏瘧原蟲(Plasmodium． berghei NK65)或約氏瘧原蟲(p.yoelii17XL)之前，應(yīng)用抗CD25單克隆抗體耗竭小鼠體內(nèi)Tregs，可通過延緩瘧原蟲的增殖速率使其致死性感染得以控制。Tregs回輸實驗證實，p.yoelii

7、17XL感染能夠特異性活化Tregs，介導瘧原蟲逃逸C57BL/6小鼠的T細胞應(yīng)答。同樣人體實驗也表明惡性瘧原蟲(P。falciparum)感染誘導Tregs分化并伴有IL-10的升高。以上結(jié)果均提示，Tregs的活化是介導惡性瘧原蟲和致死型嚙齒類瘧原蟲逃逸機體免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。 另外，人們研究發(fā)現(xiàn)在細胞亞群分化過程中，轉(zhuǎn)錄因子也具有重要的調(diào)節(jié)作用。T—bet和GATA3是兩種細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，分別特異性地表達于Th1和Th2細胞

8、。T—bet正調(diào)控Th1細胞的發(fā)育，GATA3正調(diào)控Th2細胞的發(fā)育，二者最終決定Th0向Th1/Th2的轉(zhuǎn)化。由此可以看出在瘧疾感染過程中T—bet和GATA3兩種轉(zhuǎn)錄因子也參與了Th1/Th2的極化過程。 為了解不同瘧原蟲感染過程中Th1/Th2應(yīng)答的差異是否與Tregs的免疫調(diào)節(jié)作用具有一定的相關(guān)性，本研究選用致死型約氏瘧原蟲(p.yoelii17XL，Py17XL)、夏氏瘧原蟲(p.chabaudi AS，p.cAS)及

9、其約氏+夏氏瘧原蟲(1:1)混合感染DBA/2和BALB/c小鼠，動態(tài)觀察感染過程中Th1/Th2應(yīng)答的差異、Tregs的數(shù)量變化和功能特點，并且在此基礎(chǔ)上應(yīng)用抗CD25單克隆抗體阻斷技術(shù)，以期闡明Tregs在瘧疾感染過程中的作用地位及其相關(guān)機制。 實驗方法： 1、實驗動物及其模型構(gòu)建 6—8周齡、雌性DBA/2和BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔分別感染1×106 p.y17XL、PcAS和2×106 p.y17XL+P

10、cAS(1:1)寄生的紅細胞(PRBC)，構(gòu)建不同的實驗動物模型。 2、采用雙抗體夾心ELISA法檢測小鼠感染瘧原蟲后IFN—γ和IL—4的含量 無菌取出感染小鼠脾臟，制成細胞懸液并調(diào)整脾細胞終濃度為1×107/ml，24孔培養(yǎng)板上加入細胞懸液，500μl/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清，—80℃保存，待IFN—γ和IL—4檢測。 用雙抗體夾心ELISA法對IFN—γ和IL—4的含量

11、進行檢測，酶標儀檢測450nm處OD值，應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標準品標準曲線，計算細胞因子含量(pg/ml)。 3、采用RT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)錄因子T—bet和GATA3 mRNA的表達水平 4、采用流式細胞分析技術(shù)檢測小鼠感染瘧原蟲后脾Tregs及CD4+T細胞凋亡的百分比 5、采用雙抗體夾心ELISA法檢測小鼠感染瘧原蟲后脾細胞培養(yǎng)上清抑制性細胞因子IL-10和TGF-β的含

12、量 無菌取小鼠脾臟，制成1×107/ml脾細胞懸液。24孔培養(yǎng)板中加入細胞懸液，500μl/孔，于37℃培養(yǎng)48h。350g室溫離心10min，收集上清。用雙抗體夾心ELISA法對TGF-β和IL-10的含量進行檢測，酶標儀檢測450nm處OD值。應(yīng)用SoftMax Pro4.3.1 LS軟件分析，繪制標準品標準曲線，計算細胞因子含量(pg/ml)。 6、采用細胞內(nèi)染色方法檢測小鼠感染瘧原蟲后分泌IL-10的Tregs數(shù)

13、量的百分比 無菌取小鼠脾臟，制成1×107/ml脾細胞懸液。于流式管中加入細胞懸液，500μl/管，37℃條件下PMA和伊屋諾霉素刺激2h后加入Golgi Stop共同培養(yǎng)4h，3％FCS洗滌后加入FITC—anti—CD4 and PE—anti—CD25熒光抗體，4℃孵育30min，3％FCS洗滌后加入固定透膜劑，4℃孵育20min，洗滌后加入APC—anti—IL-10(JES5—16E3)熒光抗體，4℃避光孵育30min

14、，洗滌后上機。同時用FITC rat IgG2b作為同型對照。 7、應(yīng)用抗CD25單克隆抗體阻斷技術(shù)，研究Tregs在約氏瘧原蟲感染早期相關(guān)的作用機制 BALB/c小鼠分別在感染前1d和感染后1d腹腔注射1mg的抗CD25 mAb(7D4)，腹腔注射PBS小鼠作為對照組。分別于感染0d、3d和5d常規(guī)制備脾細胞懸液，流式細胞儀檢測Tregs體內(nèi)消除后數(shù)量及其CD4+T細胞凋亡數(shù)量變化；收集脾細胞培養(yǎng)上清待Tregs體內(nèi)

15、消除后IFN—γ和IL-10水平檢測。 結(jié)論： 1、p.y17XL和p.cAS感染過程中，小鼠DBA/2和BALB/c免疫應(yīng)答存在明顯差異。 2、p.y17XL和p.cAS感染過程中，Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡對抵抗瘧疾感染至關(guān)重要，同時提示Th1和Th2型免疫應(yīng)答的發(fā)生時相和效應(yīng)強度可能最終影響著瘧疾感染結(jié)局。 3、Tregs數(shù)量的過早升高與p.y17XL感染的BALB/c小鼠Th1型

16、免疫應(yīng)答未能有效建立密切相關(guān)； 4、Tregs數(shù)量的異常活化與p.cAS感染的DBA/2小鼠未能成功的從Th1向Th2型細胞免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)化密切相關(guān)； 5、p.y17XL+p.cAS混合感染過程中，DBA/2和BALB/c小鼠免疫應(yīng)答模式與p.y17XL單獨感染DBA/2和BALB/c小鼠的應(yīng)答模式相同； 6、p.y17XL+PcAS混合感染過程中，Th1和Th2型免疫應(yīng)答的有效建立和協(xié)調(diào)過渡對抵抗瘧疾感染至關(guān)重要；