不同類型CRS的免疫病理學特性及其機制的初步探討.pdf

1、第一部分：
　　 研究目的：源于白種人的研究揭示合并鼻息肉性慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis withnasal polyps，CRSwNP)和不合并鼻息肉性慢性鼻-鼻竇炎(chronic rhinosinusitis withoutnasal polyps，CRSsNP)鼻腔粘膜表現(xiàn)出不同的炎癥形式。前者常表現(xiàn)為Th2 反應占主導的嗜酸性粒細胞炎癥反應，而后者則呈現(xiàn)Th1 主導的炎癥反應。對非白種人

2、CRSwNP和CRSsNP 患者進行系統(tǒng)研究更有利于了解慢性鼻-鼻竇炎(chronicrhinosinusitis，CRS)的發(fā)病機制。因此本研究第一步目的就是了解武漢及周邊地區(qū)CRSwNP 及CRSsNP 成人患者免疫病理學特點。
　　 研究方法:對50個正常下鼻甲組織、94個CRSsNP和151個CRSwNP 手術樣本石蠟切片進行HE 染色并進行組織學特征觀察(進行總炎癥細胞,單個核細胞,嗜酸性粒細胞,漿細胞及粘液腺體計數(shù))

3、。根據(jù)對照組織嗜酸性粒細胞占總炎性細胞百分比的均數(shù)和標準差建立分界標準將CRSsNP和CRSwNP分為嗜酸性粒細胞性CRSsNP 及CRSwNP和非嗜酸性粒細胞性CRSsNP 及CRSwNP。另外通過對17個正常下鼻甲組織、36個CRSsNP和45個CRSwNP 手術樣本進行免疫組織化學染色分析探討各種免疫細胞在對照、CRSsNP和CRSwNP中的浸潤情況,包括總T細胞(CD3+),T 輔助細胞(CD4+),細胞毒性T細胞(CD8+),

4、B細胞(CD20+)，巨噬細胞(CD68+),中性粒細胞(MPO+),樹突狀細胞(DC-LAMP+)。利用實時定量RT-PCR方法檢測T 輔助細胞亞型,包括Th1、Th2、Th17和Treg細胞核轉(zhuǎn)錄因子和相應細胞因子在對照、CRSsNP和CRSwNP中的表達情況。
　　 結(jié)果:于50％CRSwNP 患者表現(xiàn)為非嗜酸性粒細胞浸潤性炎癥反應。CRSwNP 較CRSsNP 有更多的嗜酸性粒細胞、漿細胞、CD3+、CD8+、CD20+

5、和CD68+細胞浸潤,但是MPO 陽性表達率下降。盡管Th1/Th2/Th17 核轉(zhuǎn)錄因子及細胞因子在CRSwNP和CRSsNP 均上調(diào),但是與對照相比二者FOXP3 及TGF-β1 mRNA表達率下調(diào)。
　　 CRSsNP 較CRSwNP 含有更高水平的IFN-γ，然而僅有嗜酸性粒細胞性CRSwNP(eosinophilic CRSwNP，Eos-CRSwNP)較CRSsNP 含有更高的Th2 核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3 水平和細

6、胞因子IL-5水平。除此之外，Eos-CRSwNP 較non-Eos-CRSwNP含有更高的Th2 炎癥反應（Th2 核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3和細胞因子IL-5表達上調(diào)）和Th17 炎癥反應(Th17 核轉(zhuǎn)錄因子RORC 及Th17 相關細胞因子IL-17A、IL-22 及IL-23表達顯著上調(diào))。
　　 結(jié)論:國人CRSsNP和CRSwNP 成人患者均表現(xiàn)出Treg 功能受損和增強的Th1/Th2/Th17混合型炎癥反應，但是C

7、RSsNP表現(xiàn)出更為突出的Th1 反應，以Th2 為主導的嗜酸性粒細胞炎癥反應和增高的Th17 炎癥反應僅存在于Eos-CRSwNP 而不存在于non-Eos-CRSwNP。
　　 第二部分：
　　 研究目的:
　　 在前面的研究中我們發(fā)現(xiàn)Th2 極化和突出的嗜酸性粒細胞炎癥以及增強的Th17反應僅存在于Eos-CRSwNP 而并非non-Eos-CRSwNP，然而與Eos-CRSwNP 相比中性粒細胞活化更多見

8、于non-Eos-CRSwNP，這些數(shù)據(jù)提示我們Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 潛在的發(fā)病機制和過程可能存在差異，不同的T 輔助細胞免疫反應可能是導致二者差異的原因。因此本研究目的就是⑴進一步驗證嗜酸性粒細胞及中性粒細胞在Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP中的活化狀態(tài)是否存在差異,并探討炎癥組織局部趨化嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤的化學因子; ⑵進一步檢測各T 輔助細胞細胞因子蛋白表達水平及其相應趨化

9、因子和趨化因子受體表達水平，驗證前面實驗結(jié)果及探討導致炎癥反應局部各免疫細胞浸潤的直接原因; ⑶比較兩者在臨床表現(xiàn)方面是否有差異; ⑷探討Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 形成不同免疫病理學特點的可能的影響因素。
　　 研究方法:
　　 根據(jù)我們前面建立的判定標準將CRSwNP分為Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP,比較兩者臨床表現(xiàn)。利用免疫組織化學方法探討及比較Eos-CRSwNP、n

10、on-Eos-CRSwNP和對照組織中嗜酸性粒細胞(MBP+)和中性粒細胞(MPO+)的活化狀態(tài)。利用實時定量RT-PCR方法或bio-plex 蛋白檢測技術檢測嗜酸性粒細胞趨化因子eotaxin、RANTES以及GM-CSF和中性粒細胞趨化因子IL-8 及GRO-α在不同組別中的表達及差異。Bio-plex 蛋白檢測技術檢測Th1/Th2/Th17細胞因子IFN-γ /IL-4、IL-5、IL-13 /以及IL-17，ELISA 檢測

11、Th1、Th2 趨化因子IP-10、TARC 及MDC，實時定量RT-PCR分別檢測Th1/Th2/Th17細胞趨化因子受體CXCR3、CCR4、CCR6，Th1 趨化因子MIG、I-TAC。檢測與探討外周血總IgE、常見吸入性過敏原特異性IgE以及炎性組織勻漿總IgE和常見吸入性過敏原及葡萄球菌腸毒素A、B(staphylococcus enterotoxin A、B，SEA、SEB)特異性IgE與嗜酸性粒細胞炎癥及T細胞免疫反應的相

12、關性。
　　 研究結(jié)果:
　　 39例CRSwNP 患者，其中Eos-CRSwNP 16例占41％，non-Eos-CRSwNP 23例占59％,二者臨床表現(xiàn)方面未見明顯差異。Eos-CRSwNP中活化嗜酸性粒細胞增多且與嗜酸性粒細胞炎癥成正比，non-Eos-CRSwNP 未見明顯嗜酸性粒細胞活化現(xiàn)象。與對照及non-Eos-CRSwNP 相比，Eos-CRSwNP 嗜酸性粒細胞趨化因子eotaxin表達顯著升高,而趨

13、化因子RANTES 及GM-CSF的表達三者間并無差異。Non-Eos-CRSwNP 較Eos-CRSwNP 具有更常見的中性粒細胞浸潤與活化，然而部分Eos-CRSwNP 患者也表現(xiàn)出十分顯著的中性粒細胞炎癥。與對照相比中性粒細胞趨化因子IL-8在Eos-CRSwNP和non-Eos-CRSwNP 均顯著上調(diào)，然而細胞因子GRO-α在non-Eos-CRSwNP中的表達較對照和Eos-CRSwNP 升高。與對照和non-Eos-CRS

14、wNP 相比,組織勻漿總IgE、Th17 特異性趨化受體、Th2細胞因子IL-5、IL-13以及Th2細胞特異性趨化因子受體CCR4和Th2細胞趨化因子TARC的表達在Eos-CRSwNP 均顯著上調(diào)。與對照相比，Eos-CRSwNP中Th1細胞因子IFN-γ，Th1細胞特異性趨化因子受體CXCR3表達顯著升高，而non-Eos-CRSwNP 卻并無升高。30％ Eos-CRSwNP檢測出金黃色葡萄球菌A、B 特異性IgE 而non-E

15、os-CRSwNP 及對照均未檢測出。
　　 局部總IgE與局部嗜酸性粒細胞炎癥及Th2細胞因子IL-13表達水平呈正相關。
　　 研究結(jié)論:
　　 本研究進一步證實Eos-CRSwNP與non-Eos-CRSwNP 具有不同的免疫病理學特性:
　　 Th2 極化和增強的Th17 反應僅存在于Eos-CRSwNP 而并不存在于non-Eos-CRSwNP,而non-Eos-CRSwNP 具有更常見的中性粒

16、細胞浸潤與活化。局部IgE 可能是導致不同CRSwNP表型的重要原因而葡萄球菌超抗原僅參與部分Eos-CRSwNP的發(fā)病。
　　 Eos-CRSwNP中Th2 免疫細胞及嗜酸性粒細胞分別主要由TARC和eotaxin 趨化，而GRO-α可能在non-Eos-CRSwNP中中性粒細胞趨化和活化中起重要作用。
　　 第三部分：
　　 目的：觀察不伴息肉性慢性鼻-鼻竇炎（Chronic rhiosinusitis wi

17、thoutnasal polyps，CRSsNP）病理學特點，探討肥大細胞及活化肥大細胞在CRSsNP中的作用及其與嗜酸性粒細胞炎癥的關系。
　　 方法：1.采用HE 染色對CRSsNP和對照下鼻甲組織學特點進行觀察以及對組織總炎細胞，單個核細胞，漿細胞及嗜酸性粒細胞進行計數(shù)分析.利用甲苯胺蘭和類胰蛋白酶免疫組化法分別檢測肥大細胞和活化肥大細胞在CRSsNP和對照中的浸潤情況，并探討其與組織嗜酸性粒細胞炎癥的相關性。
　　

18、 結(jié)果：CRSsNP組織中總炎性細胞，單個核細胞以及漿細胞數(shù)均高于對照組，而嗜酸性粒細胞和粘膜固有層腺體數(shù)量于二者無明顯差異.肥大細胞和活化肥大細胞計數(shù)呈相關性，但二者在CRSsNP和對照組中均未見明顯差異，且二者與組織嗜酸性粒細胞炎癥均無相關性。
　　 結(jié)論：CRSsNP 較正常對照具有更重的炎癥反應，但肥大細胞及其活化以及組織嗜酸性粒細胞二者無差異，且肥大細胞及其活化與嗜酸性粒細胞計數(shù)無相關性，提示肥大細胞及其介導的嗜酸性