恩度對(duì)腫瘤上清液誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、成管能力及MMP-2、MMP-9活性的影響.pdf

1、前言：
　　 血管生成對(duì)于胚胎發(fā)育和所有生后組織的生長(zhǎng)及修復(fù)來(lái)說(shuō)都是至關(guān)重要的。血管生成是一個(gè)包含基底膜降解、內(nèi)皮細(xì)胞粘附性降低、內(nèi)皮細(xì)胞增殖并向周?chē)|(zhì)遷移、內(nèi)皮細(xì)胞再粘附組成新的毛細(xì)血管腔的復(fù)雜的多階段過(guò)程。
　　 20世紀(jì)70年代早期有人提出了腫瘤相關(guān)性血管生成的概念。實(shí)驗(yàn)表明如果沒(méi)有新生血管,腫瘤最多只能長(zhǎng)到2-3mm3。血管生成是癌癥進(jìn)展過(guò)程中的關(guān)鍵性一步。因此推測(cè),可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力來(lái)抑制

2、腫瘤血管生成,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
　　 基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是高度保守的依賴(lài)于鋅離子的內(nèi)切蛋白水解酶家族,能夠選擇性消化細(xì)胞外基質(zhì)和非基質(zhì)蛋白。Ⅳ型膠原是細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白,Ⅳ型膠原酶MMP-2、MMP-9是降解Ⅳ型膠原最主要的酶,在血管生成早期的血管基底膜的降解中起重要作用。因此抑制MMP-2和MMP-9的活性可以有效防止血管基底膜的降解,減少腫瘤血管生成。
　　 出生后的血管生成是血管生成刺激因

3、子和抑制因子共同作用的平衡結(jié)果,一旦失衡可以導(dǎo)致炎癥、腫瘤、缺血和免疫異常等疾病[1]。抑制因子中包含一種被稱(chēng)為內(nèi)皮抑素的物質(zhì)。自然條件下,內(nèi)皮抑素的生成量很低。而人工合成的內(nèi)皮抑素臨床療效又不理想。恩度(Endostar)是一種新型的重組人血管內(nèi)皮抑素,理論上能有效抑制腫瘤中的血管生成,阻斷腫瘤細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和氧氣的供應(yīng),最終使腫瘤細(xì)胞因缺乏營(yíng)養(yǎng)供給而死亡。因此推測(cè),恩度作為一種新型的血管生成抑制劑具有廣譜的抗血管源性蛋白質(zhì)的功能,同時(shí)恩度

4、作為血管生成的直接抑制劑有以下優(yōu)點(diǎn):血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)其幾乎沒(méi)有耐藥性,可以長(zhǎng)期使用而不會(huì)引起腫瘤復(fù)發(fā)[2,3],臨床研究發(fā)現(xiàn)恩度單藥應(yīng)用也具有一定的抗腫瘤作用,且安全性好[4,5]。但是其能否特異性地作用于腫瘤微環(huán)境下的血管內(nèi)皮細(xì)胞,抑制其遷移、形成新的血管,從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)尚有待進(jìn)一步研究。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組
　　 將HUVEC置于含有10％FBS的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃、5％

5、CO2培養(yǎng)箱(FORMA)中培養(yǎng),用0.125％胰酶(含0.02％EDTA)消化、傳代。在細(xì)胞培養(yǎng)及恩度干預(yù)后,在倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。實(shí)驗(yàn)分組為恩度濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml,作用于HUVEC24小時(shí)。
　　 二、Transwell小室檢測(cè)HUVEC的遷移能力
　　 配制HUVEC懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml。將10μl細(xì)胞懸液加入Transwell遷

6、移系統(tǒng)的上層小室中,再將上層小室放入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培養(yǎng)孔中,37℃孵育24 h。PBS洗滌細(xì)胞3次,4％甲醛固定30 min,PBS再洗細(xì)胞3次,姬姆薩染色。用棉棒仔細(xì)去除上層小室側(cè)的未遷移細(xì)胞,觀察已穿過(guò)遷移杯8μm孔到達(dá)遷移杯底下面的細(xì)胞。顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍攝,計(jì)數(shù)每個(gè)視野的平均細(xì)胞數(shù)量。三、Matrigel檢測(cè)HuVEC的成管能力

7、
　　 將HUVEC接種于24孔板,每孔約1×106個(gè),培養(yǎng)24小時(shí),棄上清液,加入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml恩度的培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。將細(xì)胞用胰酶消化吹打,制成細(xì)胞懸液。將Matrigel涂于另一24孔板,每孔5μl,涂勻后培養(yǎng)箱內(nèi)靜置30分鐘,待膠凝固,將細(xì)胞懸液接種于涂有Matrigel的24孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。在倒置顯微鏡下觀察管腔形成情

8、況,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)管腔數(shù)目,并取平均值。
　　 四、明膠酶譜實(shí)驗(yàn)測(cè)定HUVEC中MMP-2、MMP-9的活性
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,用DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml,接種于24孔板,培養(yǎng)24h后離心去上清液,加入含有10％腫瘤上清液和濃度分別為0μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml的恩度,孵育24h后收取上清液。用Lowry's法測(cè)定上清液中的蛋白濃度,電泳前將樣本總

9、蛋白量調(diào)整至70μg/μl,再按5:1與上樣緩沖液混合孵育30min,上樣于含0.8g/L聚丙烯酰胺凝膠中。作SDS-PAGE,初始電壓為80V電泳30min,待溴酚藍(lán)達(dá)分離膠后加至150V電泳70-80min。電泳所得凝膠依次洗脫(40分鐘,兩次),漂洗(20分鐘,兩次),孵育(48小時(shí),37℃),用考馬斯亮藍(lán)染色4h,再脫色。凝膠圖像掃描入計(jì)算機(jī)后即可對(duì)其條帶進(jìn)行半定量分析。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用

10、SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn),P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、恩度對(duì)HUVEC遷移能力的影響
　　 Transwell小室檢測(cè)顯示,不同濃度恩度作用24小時(shí)對(duì)腫瘤上清液誘導(dǎo)的HUVEC的遷移能力有抑制作用,并呈劑量依賴(lài)性。
　　 二、恩度對(duì)HUVEC成管能力的影響
　　 不同濃度恩度作用于腫瘤上清液誘導(dǎo)的HUVEC24小時(shí),可明顯減少HUVEC形成的

11、管腔數(shù)目,并呈劑量依賴(lài)性。
　　 三、恩度對(duì)HUVEC中MMP-2、MMP-9活性的影響
　　 明膠酶譜實(shí)驗(yàn)顯示,不同濃度恩度作用于腫瘤上清液誘導(dǎo)的HUVEC24小時(shí)后,MMP-2和MMP-9的活性較對(duì)照組減弱。
　　 結(jié)論：
　　 1、恩度可抑制體外培養(yǎng)的腫瘤上清液誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移,使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力降低。
　　 2、恩度可以抑制體外培養(yǎng)的腫瘤上清液誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的