新型鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ的基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、本論文工作主要利用基因工程方法克隆和表達(dá)了一個(gè)新型肽類鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ，采用電生理學(xué)、藥理學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)和行為學(xué)方法系統(tǒng)研究了BmKαⅣ與鈉通道相互作用的分子結(jié)構(gòu)與功能基礎(chǔ)以及其可能的生物進(jìn)化地位，同時(shí)探討了其誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作的分子和細(xì)胞機(jī)制。
　　 1.新型肽類鈉通道調(diào)制劑BmKαⅣ的克隆、表達(dá)及藥理功能鑒定
　　 本研究從東亞鉗蝎毒腺基因組中首次克隆到一新型長(zhǎng)鏈蝎神經(jīng)毒素基因，命名為BmKαⅣ，并成功地實(shí)現(xiàn)

2、了其在大腸桿菌中的功能性表達(dá)。BmKαⅣ基因全長(zhǎng)898bp，由兩個(gè)外顯子和插于二者中間的一503bp內(nèi)含子組成，編碼66個(gè)氨基酸殘基的成熟多肽。毒理學(xué)結(jié)果顯示，BmKαⅣ對(duì)哺乳動(dòng)物和昆蟲均有一定毒性作用。藥理結(jié)合結(jié)果顯示，BmKαⅣ既可與大鼠大腦皮層突觸體膜結(jié)合，亦可與蟑螂腹神經(jīng)索神經(jīng)膜結(jié)合。BmKαⅣ與這兩種膜的結(jié)合可以被經(jīng)典α毒素AaHⅡ、類β毒素BmKAS、抑制型昆蟲毒素BmKIT2以及過渡型毒素BmKabT所抑制，但不能被類α毒

3、素BmKⅠ所抑制。電壓鉗結(jié)果顯示，BmKαⅣ可顯著增加表達(dá)于爪蟾卵母細(xì)胞的rNav1.2峰鈉電流，并延長(zhǎng)rNav1.2鈉電流失活化相。序列比對(duì)和模建分析結(jié)果顯示，BmKαⅣ具區(qū)別于已知的經(jīng)典α毒素、α昆蟲毒素和類α毒素的分子結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。上述結(jié)果表明：BmKαⅣ為隸屬于α蝎神經(jīng)毒素的一個(gè)新亞族，結(jié)構(gòu)和功能特征表現(xiàn)為介于經(jīng)典α、類α和α昆蟲蝎神經(jīng)毒素之間的一個(gè)新型過渡性嵌合體。因此，BmKαⅣ可作為特異性分子工具，用于電壓門控鈉通道的功能與分

4、子結(jié)構(gòu)解析，并對(duì)研究蝎神經(jīng)毒素結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)化有重要價(jià)值。
　　 2.BmKαⅣ誘發(fā)大鼠驚厥發(fā)作及其細(xì)胞機(jī)制
　　 大鼠一側(cè)腦室注射BmKαⅣ(0.5-3μg)可劑量依賴性地誘發(fā)大鼠驚厥行為發(fā)作和大腦皮層癲癇樣放電。體外電生理記錄研究顯示，BmKαⅣ可顯著增強(qiáng)表達(dá)rNav1.2的爪蟾卵母細(xì)胞自發(fā)放效應(yīng)，增加rNav1.2的persistent和resurgent電流幅值。顯微熒光離子成像結(jié)果顯示，BmKαⅣ可顯著增加大鼠腦

5、突觸體膜內(nèi)鈣離子和鈉離子濃度，并且這種效應(yīng)可以完全被TTX所抑制。以大鼠皮層突觸體為神經(jīng)末梢標(biāo)本，通過酶聯(lián)熒光法檢測(cè)結(jié)果表明，BmKαⅣ可誘發(fā)大鼠皮層突觸體的谷氨酸釋放，此效應(yīng)亦能被TTX所阻斷。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：BmKαⅣ可誘發(fā)大鼠癲癇發(fā)作；BmKαⅣ能顯著性易化鈉通道(特別是rNav1.2)介導(dǎo)的興奮性；BmKαⅣ增加大腦皮層突觸體內(nèi)鈣離子和鈉離子濃度；BmKαⅣ誘發(fā)大腦皮層突觸體谷氨酸釋放；BmKαⅣ誘發(fā)癲癇發(fā)作的可能機(jī)制為BmK