紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平及相關(guān)基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肝細(xì)胞癌的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、1981年Siegel提出了“紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)”的新概念，打破了劃分血細(xì)胞功能的傳統(tǒng)界限.2004年郭峰提出了血液免疫反應(yīng)路線圖理論，認(rèn)為血液中85％的免疫復(fù)合物被紅細(xì)胞黏附后運(yùn)送到吞噬細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除或通過(guò)遞呈給T細(xì)胞等途徑進(jìn)行殺滅，紅細(xì)胞免疫在血液免疫反應(yīng)中起主干道作用.在紅細(xì)胞免疫功能中，補(bǔ)體受體1(complement receptor type1，CR1)的免疫黏附功能和達(dá)菲抗原/趨化因子受體(Duffy antigen/

2、receptor for chemokines，DARC)的趨化因子受體功能最受關(guān)注，CD59則具有限制人補(bǔ)體系統(tǒng)溶細(xì)胞活性、介導(dǎo)紅細(xì)胞-T細(xì)胞信號(hào)傳遞的作用，而具有輔助功能的CD4+T細(xì)胞和具有抑制及直接殺傷功能的CD8+T細(xì)胞共同行使T細(xì)胞特異性免疫功能。
　　 我國(guó)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)發(fā)病率居世界首位，治療屬世界難題，肝癌發(fā)病率和死亡率居高不下。研究實(shí)踐或理論推測(cè)表明，紅細(xì)胞CR1、DARC、CD59和T細(xì)胞亞群在SL

3、E和肝細(xì)胞癌(HCC)患者發(fā)生或可能發(fā)生表型改變，但缺乏綜合、詳盡研究，且紅細(xì)胞免疫分子表型檢測(cè)方法不規(guī)范，難以保證結(jié)果可靠性和可比性；目前缺乏這些分子的基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)與疾病遺傳易感性的關(guān)聯(lián)研究，本研究探討了紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平及相關(guān)基因SNP與SLE、HCC的關(guān)聯(lián)，主要研究?jī)?nèi)容、方法和結(jié)果如下：
　　 1.紅細(xì)胞CR1、CD59、DARC分子水平測(cè)定方法的建立及優(yōu)化：采用直標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各分子水平，

4、比較數(shù)據(jù)分析方法[陽(yáng)性紅細(xì)胞百分率、幾何平均熒光強(qiáng)度(GMFI)和幾何平均熒光強(qiáng)度比值(GMFIR)]的可靠性，以及抗凝劑(EDTA-K2、肝素鋰、枸櫞酸鈉)、標(biāo)本放置時(shí)間和抗體用量對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，
　　 2.候選基因SNP位點(diǎn)檢測(cè)方法的建立及優(yōu)化：采用配對(duì)標(biāo)志法挑選候選基因標(biāo)簽SNP，設(shè)計(jì)多重引物，單重PCR驗(yàn)證多重PCR引物質(zhì)量，采用多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸.標(biāo)簽微陣列雜交基因分型技術(shù)檢測(cè)91例健康人基因組DNA候選

5、標(biāo)簽SNP，利用SNPstream()系統(tǒng)軟件確定個(gè)體基因型，分型成功率>90％的SNP位點(diǎn)入選后續(xù)研究；對(duì)46份DNA樣本重復(fù)測(cè)定，計(jì)算各SNP位點(diǎn)分型結(jié)果符合率.
　　 3.健康人紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平及相關(guān)基因SNP位點(diǎn)特點(diǎn)：檢測(cè)健康人紅細(xì)胞CR1、DARC、CD59和T細(xì)胞亞群水平以及CR1等6個(gè)基因30個(gè)SNP位點(diǎn)；基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡(HWE)的SNP位點(diǎn)入選后續(xù)研究，利用Haplo

6、view V4.1軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析，采用四配子法構(gòu)建單體型域，推算單體型頻率，分析各SNP位點(diǎn)基因分型及頻率>5％的單體型與性別的關(guān)聯(lián)；分析紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群指標(biāo)間及其與性別、年齡和SNP分型之間相關(guān)性，采用單因變量多因素一般線性模型篩選各指標(biāo)主要影響因素.
　　 4.應(yīng)激因素對(duì)紅細(xì)胞、T細(xì)胞免疫功能的影響：檢測(cè)4℃保存懸浮紅細(xì)胞及深、淺低溫體外循環(huán)(CPB)手術(shù)前后紅細(xì)胞CR1、CD59及T細(xì)胞亞群水

7、平，比較3種復(fù)合應(yīng)激因素對(duì)紅細(xì)胞、T細(xì)胞免疫的影響趨勢(shì)、程度.
　　 5.紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平及相關(guān)基因SNP與SLE的關(guān)聯(lián)：檢測(cè)SLE患者及健康人紅細(xì)胞CR1、DARC、CD59、T細(xì)胞亞群水平及27個(gè)SNP位點(diǎn)基因型，比較組間紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平和基因型、等位基因及頻率>5％的單體型的分布差異，計(jì)算比值比(OR)及其95％可信區(qū)間(CI)。
　　 6.紅細(xì)胞免疫分子、T細(xì)胞亞群水平及相關(guān)基因SNP

8、與HCC的關(guān)聯(lián)：方法同SLE病例對(duì)照研究.
　　 結(jié)論：
　　 1.成功建立并優(yōu)化了直標(biāo)法流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定紅細(xì)胞CR1、CD59、DARC水平及多重PCR-熒光標(biāo)記單堿基延伸.標(biāo)簽微陣列雜交基因分型技術(shù)檢測(cè)候選基因標(biāo)簽SNP的方法。
　　 2.調(diào)查了健康人紅細(xì)胞CR1、DARC、CD59，T細(xì)胞亞群水平，探討了各指標(biāo)間的相關(guān)性及主要影響因素，確定了CR1等6個(gè)相關(guān)基因的27個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)入選后續(xù)研究，構(gòu)建了6個(gè)單

9、體型域，各SNP位點(diǎn)基因型、等位基因、單體型頻率均無(wú)顯著性別差異。
　　 3.應(yīng)激因素可損害紅細(xì)胞、T細(xì)胞免疫.4℃保存懸浮紅細(xì)胞對(duì)紅細(xì)胞CRl-GMFIR影響小，對(duì)CD59-GMFIR影響較大.深低溫CPB手術(shù)對(duì)紅細(xì)胞免疫有輕度損害，而淺低溫CPB損害較重；深低溫CPB手術(shù)導(dǎo)致免疫抑制，淺低溫CPB手術(shù)引發(fā)炎性反應(yīng).3種復(fù)合應(yīng)激因素?fù)p害紅細(xì)胞免疫的程度依次為：4℃保存<深低溫CPB<淺低溫CPB。
　　 4.SLE患者

10、紅細(xì)胞，T細(xì)胞免疫功能降低，CR1-rs4844600、rs3818361、rs11118167， CD59-rs11585、rs12576440，CD4-rs1055141， CD8B-rs13400210、rs4832054等8個(gè)SNP位點(diǎn)以及CR1-rs11118167-rs3818361-rs17048010/TCT、CD59-rs831629-rs12576440-rs1738548-rs2231454/TGTG、CD4-rs