SLC15A4基因單核苷酸多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的關(guān)聯(lián)性研究.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種伴有多器官損害的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，由異常活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞導(dǎo)致自身抗體的高表達(dá)以及對自身抗原的免疫耐受失調(diào)。SLE的病因到目前為止仍然不是十分清楚，已知的因素包括基因水平的改變、表觀遺傳學(xué)的調(diào)控以及環(huán)境和激素等相互影響。近幾年來，在基因的水平上對SLE的病因研究有了很大的進(jìn)展，研究者們通過候選基因分析以及全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide associationstudies GWASs)等方法

2、已經(jīng)確認(rèn)了超過40個SLE的易感基因。
　　基因SLC15A4（solute carrier family15，member4）屬于質(zhì)子偶聯(lián)組氨酸及寡肽轉(zhuǎn)運(yùn)體家族，它含有12個跨膜結(jié)構(gòu)域且能夠?qū)⒔M氨酸及寡肽從溶酶體內(nèi)部轉(zhuǎn)運(yùn)至胞漿，包括L-丙氨酸-g-D-谷氨酸-內(nèi)消旋二氨基庚二酸多肽(L-Ala-g-D-Glu-meso-diaminopimelicAcid，tri-DAP)，核苷酸結(jié)合寡聚化學(xué)結(jié)構(gòu)域-1(nucleotide o

3、ligomerization domain-1，NOD1)配體和肌肽。SLC15A4最常見的表達(dá)部位是大腦和免疫細(xì)胞，尤其是漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞。既往的研究者們對SLC15A4基因突變或缺失的老鼠模型的研究，發(fā)現(xiàn)SLC15A4基因的缺失會導(dǎo)致NOD1，Toll樣受體7(TLR7)和Toll樣受體9(TLR9)依賴的細(xì)胞因子如Ⅰ型干擾素的表達(dá)下降，而這些受體及細(xì)胞因子在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著非常關(guān)鍵的作用。此外，在紅斑狼瘡的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)S

4、LC15A4的缺乏會減少B細(xì)胞中自身抗體的產(chǎn)生，并且其對包括抗DNA抗體和抗小核核糖核蛋白（anti-snRNP）在內(nèi)的IgG2a和IgG2c類自身抗體的產(chǎn)生非常關(guān)鍵。最近的研究也表明，SLC15A4參與維持內(nèi)體pH值的穩(wěn)定以及在固有免疫中被TLR7，TLR9，NOD1和NOD2所激活的通路中起非常關(guān)鍵的作用。在一項關(guān)于SLC15A4缺失的小鼠模型的研究，證明小鼠體內(nèi)的漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞的功能受損并且導(dǎo)致了其慢性病毒性感染。最近一個研究小

5、組發(fā)現(xiàn)在狼瘡小鼠模型的B細(xì)胞中SLC15A4對于由TLR7信號通路所所激活產(chǎn)生的IFN-Ⅰ和自身抗體的分泌起著關(guān)鍵性的作用，SLC15A4的缺失能夠使內(nèi)溶酶體的pH值紊亂，并且可能是通過改變v-ATP酶的完整性來實現(xiàn)這一結(jié)果，而這些改變又可以使哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)通路失調(diào)，最終導(dǎo)致IFN調(diào)節(jié)因子7(IFNregulatory factor7，IRF7）-IFN-Ⅰ

6、調(diào)節(jié)回路的紊亂。在這個調(diào)控回路中，SLC15A4轉(zhuǎn)運(yùn)體的活化程度在對于由TLR觸發(fā)的信號通路中細(xì)胞因子的產(chǎn)生中占有這不可或缺的地位，整個研究揭示了被SLC15A4所調(diào)控的內(nèi)溶酶體環(huán)境的完整性在TLR7激發(fā)的信號通路中的重要性，以及其對于依賴于mTOR信號通路的IRF7-IFN-Ⅰ調(diào)節(jié)回路所分泌自身抗體的影響。
　　既往的GWAS研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在韓國人和中國人中間，SLC15A4是一個與紅斑狼瘡發(fā)病相關(guān)的位點(diǎn)。2009年的一個關(guān)于中國

7、漢族的GWAS研究第一次報道SLC15A4是SLE的的易感基因，研究者們檢測出2個SNPs(rs10847697，rs1385374)位點(diǎn)在SLE患者與對照組之間有顯著性的差異。隨后，另一個研究小組對其中一個SNP(rs10847697)位點(diǎn)進(jìn)行了基因型-表形的分析，發(fā)現(xiàn)其在患有盤狀紅斑狼瘡的SLE患者中的表達(dá)顯著高于無盤狀紅斑狼瘡的患者。在高加索人群中的研究發(fā)現(xiàn)，SLA15A4的2個SNPs(rs10847697，rs1385374)

8、的水平與SLE患者狼瘡腎的發(fā)病有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性?？偟膩碚f，大量的研究都表明，SLC15A4基因多態(tài)性在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用。
　　在本研究中，我們通過收集中國西南部地區(qū)漢族人口中的355例SLE患者以及375例健康者的外周血，對SLC15A4的基因多態(tài)性與SLE的關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)性分析。我們主要集中在SLC15A4中18個SNP位點(diǎn)的等位基因和基因型在SLE與健康者中的表達(dá)差異，相關(guān)SNP位點(diǎn)與SLE的主要臨床表現(xiàn)相關(guān)性

9、分析，以及18個SNP之間的連鎖不平衡分析，最后我們對SLC15A4基因在外周血中mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)行了分析。
　　目的:既往的研究已經(jīng)報道SLC15A4在SLE的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵性的作用，本課題為了研究SLC15A4基因多態(tài)性與SLE易感性之間的關(guān)聯(lián)，通過比較355名SLE患者與375名健康對照者中SLC15A4基因18個SNP位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型以及相應(yīng)遺傳模型的分布差異，分析各個位點(diǎn)的基因頻率以及遺傳模型與SLE

10、的易感性關(guān)系，并構(gòu)建18個SNP位點(diǎn)的單體型分析與SLE的關(guān)聯(lián)，結(jié)合患者臨床信息，分析各存在顯著差異的位點(diǎn)與疾病表型間的關(guān)聯(lián)性。最后檢測SLC15A4基因mRNA及蛋白表達(dá)差異，期望為SLE提供新的潛在的治療靶點(diǎn)。
　　方法:
　　1.本研究采用病例對照研究的方法，分別對355例診斷明確的SLE患者與375例健康對照者進(jìn)行了分析，所有的病例均來源于從2008年1月到2013年3月期間就診于重慶市第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院皮膚科且診

11、斷明確的SLE患者，所有患者均達(dá)到1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(American College of Rheumatology)修訂的SLE分類標(biāo)準(zhǔn)并且排除其他系統(tǒng)性或自身免疫病。健康對照組均來自于該院健康體檢中心，對照者均無重大疾病且無任何SLE分類標(biāo)準(zhǔn)中的一項。在選取的18個SNP位點(diǎn)中對其中16個采用基質(zhì)輔助激光解析電力飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(MSLDI-TOF MS)檢測其等位基因頻率及基因型在患者組和對照組之間的差別。剩余兩個SNP位

12、點(diǎn)(rs7965732，rs3765108)則采用TaqMan雜交法在羅氏LightCycler480實時熒光定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行基因頻率及基因型檢測。病例組及對照組均用卡方檢驗進(jìn)行哈迪-溫伯格平衡檢驗（Hardy-Weinberg equilibrium test），等位基因頻率、基因型頻率以及單體型頻率分析均采用卡方檢驗和logistic回歸模型完成，連鎖不平衡的構(gòu)建及差異分析應(yīng)用Haploview軟件及l(fā)ogistic回歸完成，所

13、有數(shù)據(jù)分析均使用SPSS17.0版完成，P＜0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.檢測SLC15A4基因mRNA及蛋白在SLE患者及健康對照之間的表達(dá):選取15名診斷明確的SLE患者，所有患者均符合ACR分類標(biāo)準(zhǔn)，選取10名健康對照，均無其他重大疾病及ACR分類標(biāo)準(zhǔn)中任何一項。采用實時熒光定量PCR和免疫印記法，在PBMC中分別對SLC15A4基因mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行了檢測，實驗數(shù)據(jù)使用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P＜0

14、.05為存在統(tǒng)計學(xué)差異。
　　主要結(jié)果:
　　1.SLC15A4基因多態(tài)性的等位基因頻率分布:在本次研究的18個位點(diǎn)中，其中5個在SLE患者和健康對照之間有顯著的差異。下列SNP與增加SLE的發(fā)病風(fēng)險相關(guān):rs959989T(OR=1.317,95％CI=1.027-1.689)，rs1385374T(OR=1.332,95％CI=1.039-1.707),以及rs983492T(OR=1.295，95％CI=1.001-1

15、.675)。下列SNP與降低SLE的發(fā)病風(fēng)險相關(guān):rs12298615G(OR=0.778,95％CI=0.606-0.998)和rs10847697G(OR=0.770,95％CI=0.600-0.986)。
　　2.SLC15A4基因多態(tài)性的基因型分布頻率:我們分別在共顯性、顯性以及隱性模型下對SLE患者和健康對照者進(jìn)行基因型的分析。在共顯性模型分析中，我們發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs3765108中的基因型AG顯著高于基因型AA(P=0.0

16、19，OR=1.447，95％CI=1.063-1.970)，位點(diǎn)rs7308691中的基因型AT分布頻率明顯高于基因型AA分布頻率(P=0.049，OR=1.645，95％CI=1.000-2.705)。在顯性模型中發(fā)現(xiàn)位點(diǎn)rs1385374與SLE的發(fā)病顯著相關(guān)(TT+CTvsCC，P=0.042,OR=1.1363,95％CI=1.010-1.840)。
　　3.SLC15A4基因SNP位點(diǎn)與疾病表型的關(guān)聯(lián)分析:①在325例

17、SLE患者中，對陽性體征患者與陰性體征患者進(jìn)行比較，位點(diǎn)rs959989，rs1385374，rs10847697和rs12298615與SLE患者中盤狀紅斑的發(fā)生存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與面部蝶形紅斑、口腔潰瘍、光敏感、漿膜炎、腎臟異常、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常、免疫體統(tǒng)異常、抗核抗體均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);位點(diǎn)rs983492與SLE患者中腎臟異常的發(fā)生存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與面部蝶形紅斑、盤狀紅

18、斑、口腔潰瘍、光敏感、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常、免疫體統(tǒng)異常、抗核抗體均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。②在陽性體征患者與健康對照組的比較中，位點(diǎn)rs959989，rS1385374，rs983492和rs12298615與SLE患者面部蝶形紅斑、盤狀紅斑、口腔潰瘍、光敏感、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)異常、腎臟異常、免疫系統(tǒng)異常的發(fā)生均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與神經(jīng)系統(tǒng)異常、抗核抗體無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);位

19、點(diǎn)rs983492與SLE患者面部蝶形紅斑、光敏感、漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、血液系統(tǒng)異常、腎臟異常、免疫系統(tǒng)異常、抗核抗體均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與盤狀紅斑、口腔潰瘍、神經(jīng)系統(tǒng)異常均無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。③在陰性體征患者與健康對照組的比較中，位點(diǎn)rs959989和rs1385374與面部蝶形紅斑、盤狀紅斑、口腔潰瘍、光敏感、漿膜炎、腎臟異常、血液系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常、免疫體統(tǒng)異常均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與關(guān)節(jié)炎、抗

20、核抗體無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);位點(diǎn)rS983492和rs12298615與面部蝶形紅斑、盤狀紅斑、光敏感、漿膜炎、腎臟異常、血液系統(tǒng)異常、神經(jīng)系統(tǒng)異常、免疫體統(tǒng)異常均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與關(guān)節(jié)炎、口腔潰瘍、抗核抗體無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);位點(diǎn)rS983492與面部蝶形紅斑、光敏感、漿膜炎、腎臟異常、血液系統(tǒng)異常、免疫系統(tǒng)異常均存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，與盤狀紅斑、口腔潰瘍、神經(jīng)系統(tǒng)異常、抗核抗體均無統(tǒng)計學(xué)差

21、異(P＞0.05)。
　　4.連鎖不平衡分析:應(yīng)用Haploview軟件對18個SNP位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)存在2個單體型塊。單體型塊1長度為1kb并包括以下3個SNPs:rs7965732,rs3765108和rs7308691，單體型塊2長度為29kb并包含以下15個SNPs:rs7302634,rs9738216,rs2291350,rs11059915,rs12298615,rs4760592,rs959989,rs9

22、59987,rs7311875，rs11059925，rS10847697，rs1385374，rs10847699，rs983492和rs1552336。所有頻數(shù)小于等于5的單體型被整合到一起來簡化整個統(tǒng)計分析過程，同時把每個單體型塊中出現(xiàn)頻數(shù)最高的單體型作為與SLE相關(guān)性分析的參照模版。在單體型塊1中，頻率最高的單體型是AAT，其在SLE患者和對照組的頻率分別為57.3％和57.2％，其他單體型與其相比較未發(fā)現(xiàn)存在明顯統(tǒng)計學(xué)差異。在

23、單體型塊2中，頻率最高的單體型是TTTGGCACAAGCTTC，其在SLE患者及健康對照組的比例分別為31.7％和31.5％，其次為單體型CCCGAGTCAAATTTC的頻率在SLE與對照組中分別為24.2％和17.4％，其與單體型TTTGGCACAAGCTTC相比較發(fā)現(xiàn)在患者中和對照組中存在顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.033，OR1.376,95％ CI=1.026-1.845)。
　　5.SLC15A4基因mRNA及蛋白在SLE患

24、者及健康對照之間的表達(dá):與健康對照組相比，SLC15A4基因mRNA表達(dá)在SLE患者的PBMC中要顯著升高，兩組之間存在統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)，而SLC15A4基因編碼的蛋白表達(dá)略高于對照組，兩組之間無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。
　　主要結(jié)論:我們的研究證明5個SNP位點(diǎn)(rs959989，rs1385374，rs983492，rs12298615，和rs10847697)在SLE中存在顯著差異，可能是作為SLE的發(fā)病危

25、險因子之一，共顯性模型分析揭示SNP位點(diǎn)rs3765108的基因型AG與AT在SLE患者與對照組中存在顯著差異，顯性模型分析顯示位點(diǎn)rs1385374的基因型TT+CT在SLE患者中顯著高于基因型CC，疾病表型分析發(fā)現(xiàn)盤狀紅斑及狼瘡腎炎與5個SNP位點(diǎn)存在顯著相關(guān)性，單體型塊分析發(fā)現(xiàn)單體型CCCGAGTCAAATTTC與SLE的發(fā)病相關(guān)，SLC15A4基因mRNA及蛋白SLE患者中的表達(dá)均高于對照組，因此，SLC15A4基因的單核苷酸多