CD147-EMMPRIN與轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中破骨細胞活化機制的相關(guān)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 骨組織是腫瘤晚期常見的轉(zhuǎn)移部位，諸多惡性腫瘤晚期均易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，其發(fā)生率要明顯高于骨原發(fā)惡性腫瘤，其原發(fā)灶多來自前列腺癌、乳腺癌及肺癌等惡性腫瘤的晚期。腫瘤骨轉(zhuǎn)移后多以溶骨性骨破壞為主，為患者帶來骨質(zhì)疏松、病理性骨折、進行性骨痛、高鈣血癥、脊髓壓迫綜合征等并發(fā)癥，顯著降低患者的5年生存率，嚴(yán)重影響患者的健康及生活質(zhì)量。
　　 腫瘤骨轉(zhuǎn)移是由腫瘤-骨微環(huán)境中，一系列細胞因子所參與的惡性循環(huán)過程，包括

2、腫瘤細胞、骨細胞及基質(zhì)之間的相互作用，從而導(dǎo)致腫瘤生長及骨質(zhì)破壞。破骨細胞(osteoclasts，OCs)作為骨破壞吸收的關(guān)鍵細胞，腫瘤細胞可通過多種途徑及多種因素來促進其形成及異常活化來介導(dǎo)溶骨性骨破壞的發(fā)生，因此OCs作為研究及防治腫瘤骨破壞的關(guān)鍵點，我們將予以深入研究。
　　 CD147又名細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子(extracellular matrix metalloproteaseinducer，EMMPRIN

3、)與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)CD147能夠誘導(dǎo)單核/巨噬細胞活化，并通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的產(chǎn)生，參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)軟骨、骨組織的降解破壞過程及牙周炎牙槽骨破壞過程。在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)當(dāng)抑制CD147在乳腺癌細胞的過表達時，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移及骨破壞進程均得到有效延緩。因此我們相信在腫瘤骨轉(zhuǎn)移及骨破壞過程中，可能有CD147直接或間接的參與，且經(jīng)本實驗

4、組前期體外細胞研究發(fā)現(xiàn)CD147可高表達于OCs表面，并參與OCs的生成及活性調(diào)節(jié)。鑒于CD147發(fā)揮多種生物學(xué)活性均與其介導(dǎo)MMPs的產(chǎn)生密切相關(guān)，而MMPs又是OC活化過程中一種重要的調(diào)節(jié)因子，由此我們推測在腫瘤轉(zhuǎn)移后的溶骨性破壞過程中存在著腫瘤細胞通過CD147激活OCs介導(dǎo)骨破壞的發(fā)生，其調(diào)節(jié)機制可能與MMPs的產(chǎn)生相關(guān)。
　　 因此本研究通過體外建立外周血單個核細胞(peripheral blood mononucle

5、ar cells，PBMCs)向OCs分化成熟的模型，研究CD147與OCs分化過程中MMPs合成、分泌及活性調(diào)節(jié)的相關(guān)性，探討CD147對OCs活化調(diào)節(jié)的機制和方式；通過檢測轉(zhuǎn)移性骨腫瘤。
　　 臨床標(biāo)本中CD147的表達情況，及CD147與腫瘤骨破壞過程中OCs活化的關(guān)系，初步驗證前期體外實驗的結(jié)論，從而完善對CD147參與腫瘤骨破壞過程的認(rèn)識，并為本課題組的下一步深入研究提供相關(guān)實驗參考和理論依據(jù)。
　　 方法：<

6、br>　　 1.Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞，貼壁法純化所分離的外周血單個核細胞；
　　 2.引入外源性巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)蛋白和細胞核因子κB受體活化因子配基(receptor or activator ofNF-KB ligand，RANKL)蛋白誘導(dǎo)PBMCs向OCs分化，利用TRAP染色和骨吸收實驗觀察及鑒定誘導(dǎo)生

7、成的細胞，并檢測其骨吸收功能；
　　 3.實驗分別分為第一部分兩組[對照組(正常誘導(dǎo)組)和蛋白組]和第二部分兩組[對照組(正常誘導(dǎo)組)和抗體組]；
　　 4.對誘導(dǎo)培養(yǎng)第12天的細胞，進行形態(tài)學(xué)觀察及抗酒石酸的酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)染色鑒定，對與細胞共培養(yǎng)第30天的骨薄片，進行甲苯胺藍染色，觀察骨薄片表面骨吸收陷窩情況；
　　 5.Real-

8、time PCR檢測24h與48h時相點上OCs誘導(dǎo)分化過程中CD147 mRNA、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)mRNA及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)mRNA的表達情況，及分析三者的相關(guān)性；
　　 6.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測24h與48h時相點上OCs誘導(dǎo)分化過程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的表達

9、情況；
　　 7.明膠酶譜法檢測OCs在24h與48h分泌的MMP-2、MMP-9酶蛋白活性變化情況；
　　 8.免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2、MMP-9蛋白的表達情況；
　　 9.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147 mRNA、MMP-2 mRNA及MMP-9 mRNA的表達情況；
　　 10.蘇木素-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色及TRAP染

10、色觀察及鑒定轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs的情況；
　　 11.免疫組化SP法初步檢測CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs內(nèi)的表達情況；
　　 12.采用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用Ficoll密度梯度離心法，分離外周靜脈血獲得單個核細胞，并通過延長貼壁時間純化細胞的方法，可以獲得數(shù)量較多、純度較好的單個核細胞，能夠滿足體外細胞實驗需求

11、；
　　 2.引入外源性RANKL蛋白和M-CSF蛋白能夠誘導(dǎo)外周血單個核細胞生成TRAP染色陽性的單核或多核細胞，并具有骨吸收能力；
　　 3.TRAP染色結(jié)果示：蛋白組第12天TRAP(+)細胞數(shù)及體積顯著高于對照組，且生成體積巨大的多核破骨細胞；抗體組第12天TRAP(+)細胞數(shù)及體積顯著低于對照組，且未見多核破骨細胞形成。骨吸收實驗結(jié)果示：蛋白組及對照組均形成明顯的骨吸收陷凹；蛋白組形成大片狀骨吸收陷窩，面積顯著

12、大于對照組；抗體組卻未見骨吸收陷凹形成；
　　 4.Real-time PCR結(jié)果顯示：24、48 h時相點上蛋白組細胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05)；24h、48 h時相點上抗體組細胞CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA相對表達量均顯著低于對照組(P<0.05)；兩次實驗中MMP-2、MMP-9 mRNA的相對表達量與CD147 mRNA的相對表達量均呈正相關(guān)關(guān)系

13、[(R=0.818和R=0.758，P<0.05)，(R=0.525和R=0.552，P<0.05)]；
　　 5.ELISA檢測結(jié)果顯示：在24h與48 h時相點上蛋白組細胞MMP-2及MMP-9酶蛋白的分泌量均顯著高于相應(yīng)的對照組(P<0.05)；
　　 6.明膠酶譜法檢測結(jié)果顯示(酶蛋白活性以條帶酶解量代表)：抗體組MMP-2、MMP-9酶原及活性酶條帶的酶解量與對照組間比較具有顯著差異(P<0.05)，且在24h

14、、48h時相點上抗體組MMP-2、MMP-9酶原及活性酶條帶的酶解量均顯著低于相應(yīng)的對照組(P<0.05)；
　　 7.免疫組化SP法檢測轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9蛋白的表達情況，結(jié)果示：CD147、MMP-2、MMP-9蛋白在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中高表達，且顯著高于良性骨腫瘤中的表達(P<0.05)；
　　 8.RT-PCR檢測轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的表達情況，結(jié)果示：

15、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中CD147、MMP-2及MMP-9 mRNA的相對表達量均顯著高于良性骨腫瘤(P<0.05)，且MMP-2、MMP-9 mRNA的相對表達量與CD147 mRNA的相對表達量均成正相關(guān)關(guān)系(R=0.795和R=0.956，P<0.05)；
　　 9.HE染色及TRAP染色觀察及鑒定轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs的形態(tài)，結(jié)果示：轉(zhuǎn)移性骨腫瘤組織標(biāo)本中可見到多個多核巨細胞，分布于腫瘤組織與骨組織交界面的位置，經(jīng)TRAP染色鑒

16、定該多核巨細胞為TRAP染色陽性的破骨細胞；
　　 10.免疫組化SP法初步檢測CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本中OCs內(nèi)的表達情況，結(jié)果示：CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤標(biāo)本內(nèi)的破骨細胞胞漿及胞膜中，均呈現(xiàn)棕黃色的陽性反應(yīng)。
　　 結(jié)論：
　　 1.使用外源性M-CSF蛋白及RANKL蛋白共同誘導(dǎo)外周血單個核細胞向破骨細胞分化的方法，能夠誘導(dǎo)生成TRAP染色陽性，具有骨吸收能力的破骨細胞，此模型建立方法較為可靠，可以滿足

17、體外細胞實驗的要求；
　　 2.外源性CD147蛋白增強破骨前體細胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水平的表達，且能夠促進體外OCs分化過程中MMP-2、MMP-9蛋白的分泌，提示外源性CD147可能與破骨細胞分化過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的合成及分泌相關(guān)；
　　 3.CD147單克隆抗體(CD147 monoclonal antibodies，CD147mAb)能降低破骨前體細胞CD147、MMP-2及MMP-9基因水

18、平的表達，且能夠降低體外OCs分化過程中MMP-2、MMP-9酶蛋白的活性，提示內(nèi)源性CD147可能與破骨細胞分化過程中基質(zhì)金屬蛋白酶的表達及活性調(diào)節(jié)相關(guān)；
　　 4.CD147、MMP-2及MMP-9在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中高表達，且CD147與MMP-2、MMP-9的表達均呈正相關(guān)關(guān)系，提示三者可能與腫瘤骨轉(zhuǎn)移及骨破壞過程密切相關(guān)；
　　 5.CD147在轉(zhuǎn)移性骨腫瘤中破骨細胞內(nèi)高表達，初步提示CD147可能與轉(zhuǎn)移性骨腫瘤骨