CD147上調(diào)表達與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機制研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面進行了論述：
　　第一部分 CD147在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細胞中的表達情況
　　目的：研究結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細胞株中的CD147表達情況。
　　方法：收集2013年到2014年間在山東大學附屬省立醫(yī)院胃腸外科由同一手術(shù)團隊確診并行根治性手術(shù)的結(jié)腸癌患者40例。根據(jù)患者性別、年齡、腫瘤分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、局部浸潤情況、遠處轉(zhuǎn)移情況分別進行分組計數(shù)，選取結(jié)腸癌組織細胞及對應(yīng)的切緣腫瘤檢測陰性的正常結(jié)腸

2、組織細胞，分別采用實時定量PCR(quantificational real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)及蛋白印跡法(Western blot)分別對兩組細胞中CD147表達情況進行檢測。同時選取購自于中國科學院生物細胞庫的結(jié)腸癌細胞株Caco-2，SW480，HCT116， HCT15，分別采用實時定量PCR(qRT-PCR)及蛋白印跡法(Western blot)分別對四組細胞中C

3、D147表達情況進行檢測，明確CD147在上述組織及細胞中的表達情況，并用統(tǒng)計學方法分析其差異性。同時根據(jù)CD147在結(jié)腸癌組織的表達高低對40例病例進行了分組，并與患者的臨床病理因素分別進行統(tǒng)計學分析，以探討CD147表達在結(jié)腸癌組織中表達與結(jié)腸癌不同的臨床病理因素的相關(guān)性。
　　結(jié)果：結(jié)腸癌組織試驗中，mRNA檢測中有55％(22/40)的病例是高表達的，而蛋白檢測中62.5％(25/40)是呈高表達的。同時結(jié)腸癌細胞系SW4

4、80，Caco-2，HCT116， HCT15中CD147均呈高表達，其中SW480細胞系具有最高的表達，而Caco-2細胞系呈現(xiàn)出最低的表達。為了進一步驗證結(jié)腸癌組織中CD147表達情況與結(jié)腸癌臨床病理因素的關(guān)系，我們根據(jù)結(jié)腸癌組織中CD147表達的高低進行分組，分組依據(jù)為表達相差1.5倍。然后與患者臨床病理因素進行統(tǒng)計學分析(P＜0.05)，結(jié)果表明，性別因素:P=0.804，年齡因素:P=0.8，腫瘤分分化程度:P=0.673，局

5、部浸潤情況:P=0.055，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:P=0.033，遠處轉(zhuǎn)移:P=0.327。這表明CD147的上調(diào)表達與結(jié)腸癌浸潤轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。
　　結(jié)論：明確了CD147在結(jié)腸癌組織及結(jié)腸癌細胞株中均存在表達，在4組結(jié)腸癌細胞株中，SW480細胞系具有最高的表達，而Caco-2細胞系呈現(xiàn)出最低的表達。結(jié)腸癌組織中CD147的上調(diào)表達與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性。
　　第二部分 CD147的上調(diào)表達與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系

6、r>　　目的：進一步通過細胞實驗研究CD147上調(diào)表達與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系
　　方法：根據(jù)第一部分實驗的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細胞株中表達差異明顯的兩組細胞株SW480，Caco-2。本部分實驗中，我們選取這兩組細胞系進行細胞轉(zhuǎn)染實驗，在Caco-2中分別轉(zhuǎn)染入CD147高表達質(zhì)粒，及陰性對照組的空載質(zhì)粒，分別命名為Caco-OvCD147及Caco-cCD147。在結(jié)腸癌細胞株SW480分別轉(zhuǎn)染SiRNA載體質(zhì)粒和對照

7、空載質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染的細胞株分別命名為SW480-SiCD147和SW480-cCD147。經(jīng)過篩選培養(yǎng)穩(wěn)定的克隆細胞株，然后分別進行實時定量PCR及western blot實驗，驗證新建立的細胞株中的CD147表達情況。然后選用CCK-8實驗驗證CD147誘導結(jié)腸癌細胞對5-FU的耐藥，選用Transwell實驗驗證CD147對結(jié)腸癌細胞的侵襲能力的影響，選用細胞劃痕實驗驗證CD147對結(jié)腸癌細胞遷移能力的影響。
　　結(jié)果：通過細胞轉(zhuǎn)

8、染實驗建立了兩組CD147具有顯著差異的細胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147，并通過qRT-PCR及Western blot實驗證實轉(zhuǎn)染后各組新的細胞株中CD147的表達情況。經(jīng)過轉(zhuǎn)染后的新的細胞株表明Caco-OvCD147中CD147的表達明顯高于Caco-cCD147;而SW480-SiCD147細胞中CD147的表達明顯低于SW480-cCD147。CCK

9、-8實驗表明CD147過表達的Caco-OvCD147的結(jié)腸癌細胞在5-FU刺激下存活明顯高于對照組Caco-cCD147，而經(jīng)過轉(zhuǎn)染小干擾RNA的SW480-SiCD147結(jié)腸癌細胞存活明顯低于對照組SW480-cCD147。Transwell實驗表明，Caco-OvCD147細胞株的侵襲能力明顯優(yōu)于Caco-cCD147，而SW480-SiCD147的侵襲能力弱于SW480-cCD147。細胞劃痕實驗則表明Caco-OvCD147細

10、胞株的細胞遷移能力明顯優(yōu)于Caco-cCD147，而SW480-SiCD147的遷移能力弱于SW480-cCD147。
　　結(jié)論：CCK-8實驗表明CD147上調(diào)表達的的細胞株能誘導腫瘤細胞對5-FU的耐藥，而Transwell實驗及細胞劃痕實驗則表明CD147上調(diào)表達的細胞株侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯增強。從而證明了CD147的上調(diào)表達與結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移有明顯相關(guān)性。
　　第三部分 EMT過程及MAPK/ERK通路參與CD147介導的

11、結(jié)腸癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的研究
　　目的：研究細胞上皮間質(zhì)過渡過程EMT及MAPK/ERK信號通路在CD147介導的結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中作用。
　　方法：通過細胞轉(zhuǎn)染實驗建立了兩組CD147表達水平具有顯著差異的細胞株Caco-OvCD147和Caco-cCD147以及SW480-SiCD147和SW480-cCD147，并通過qRT-PCR及Western blot實驗證實轉(zhuǎn)染后各組新的細胞株中CD147的表達情況。然后通過實時

12、定量PCR及western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后的各細胞系中EMT過程中的標志物E-cadherin、vimentin以及金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達;同時用qRT-PCR及Western blot實驗檢測轉(zhuǎn)染后各組細胞株的pERK及總ERK水平。為了進一步驗證MAPK通路參與CD147介導的結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移，先用MEK抑制劑U0126干預處理處理了Caco-OvCD147和Caco-cCD147細胞株，然后通過Tra

13、nswell實驗及細胞劃痕實驗進一步驗證處理后的細胞的侵襲遷移能力，并且用Western blot實驗檢測了經(jīng)U0126處理后兩組細胞系Caco-OvCD147和Caco-cCD147中MMP-2，MMP-9的表達情況。
　　結(jié)果：在CD147過表達的Caco-OvCD147細胞株較Caco-cCD147中E-cadherin是表達下調(diào)的，vimentin的表達是上調(diào)的，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達是上調(diào)的，在SW4

14、80-SiCD147細胞株較SW480-cCD147中，E-cadherin是表達上調(diào)的，vimentin的表達是下調(diào)的，金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-2，MMP-9的表達是下降的，CD147的上調(diào)表達的細胞株Caco-OvCD147中pERK的表達較Caco-cCD147明顯增高，轉(zhuǎn)染SiRNA的細胞株SW480-SiCD147中pERK的表達水平較SW480-cCD147的表達水平明顯減少，然而總的ERK水平是不變的。經(jīng)過U0126干預處理

15、的細胞株Caco-OvCD147中MMP-2， MMP-9表達水平較經(jīng)U0126干預處理的Caco-cCD147水平減少。Transwell實驗表明經(jīng)過U0126干預處理的細胞株Caco-OvCD147細胞侵襲能力弱于經(jīng)U0126干預處理的Caco-cCD147細胞;細胞劃痕實驗表明經(jīng)過U0126干預處理的細胞株Caco-OvCD147細胞遷移能力弱于經(jīng)U0126干預處理的Caco-cCD147細胞。
　　結(jié)論：細胞實驗結(jié)果表明C