microRNA-185-5p-YWHAZ軸調(diào)控結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的機制研究.pdf

1、目前結(jié)腸癌是全世界發(fā)病率和死亡率均排名第三的惡性腫瘤，嚴重危害人類的健康和生活質(zhì)量。臨床實踐和研究發(fā)現(xiàn)發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移是導致結(jié)腸癌治療失敗和預后不良的主要原因。最新研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤發(fā)生遠處器官轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，深入探索哪些分子和信號傳導通路參與了結(jié)腸癌EMT過程，發(fā)現(xiàn)可以逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌EMT的關(guān)鍵分子靶點，在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟對其進行有效干預從而抑制結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移，具有重要的理論意義和臨床應用價值。迄今為止研究發(fā)現(xiàn)多個與結(jié)

2、腸癌EMT及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，拓寬了我們對該領域的認識的視野和角度。然而EMT的發(fā)生涉及多個基因和信號通路，因此尋找更為有效的分子靶點才能達到理想的診斷和治療效果。
　　microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度為19-26個堿基的單鏈RNA，它們在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。目前研究認為microRNA通過負性調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯，在腫瘤EMT和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用，并且單一microRNA可以同時負性調(diào)控多個靶基因的表達，但

3、迄今為止僅少數(shù)microRNA被證實參與腫瘤EMT發(fā)生發(fā)展。本實驗室前期研究表明：與結(jié)腸癌低轉(zhuǎn)移細胞系相比，microRNA-185-5p是在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細胞系中表達下調(diào)最明顯的分子，它可以抑制結(jié)腸癌細胞的侵襲遷移及EMT。發(fā)現(xiàn)并證實microRNA-185-5p發(fā)揮作用的關(guān)鍵下游靶基因有可能為揭示結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的具體分子機制提供一個新的線索。
　　目的：
　　探討microRNA-185-5p-YWHAZ軸在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移

4、及EMT中發(fā)揮的作用及機制。
　　方法：
　　1.利用生物信息學軟件預測、mRNA芯片、i-TRAQ蛋白質(zhì)譜技術(shù)三種方法聯(lián)合篩選microRNA-185-5p的功能靶基因，雙熒光素酶報告基因?qū)嶒瀸icroRNA-185-5p功能靶基因進行驗證。
　　2.qRT-PCR和Western-blotting實驗驗證靶基因在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細胞系SW620和低轉(zhuǎn)移細胞系SW480中的表達。
　　3.免疫組織化學染色驗證靶基

5、因在結(jié)腸癌組織的表達情況，并分析其表達與臨床各項病理參數(shù)的相關(guān)性。
　　4.利用Transwell實驗、細胞免疫熒光染色、Western-blotting實驗驗證靶基因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲遷移及EMT表型的調(diào)節(jié)作用；利用裸鼠尾靜脈成瘤實驗驗證靶基因?qū)τ诮Y(jié)腸癌細胞肝臟轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　5.利用Western-blotting實驗驗證YWHAZ與microRNA-185-5p之間負調(diào)控作用，通過Transwell實驗和Weste

6、rn-blotting實驗進行microRNA-185-5p-靶基因?qū)Y(jié)腸癌細胞侵襲遷移及EMT的表型研究。
　　結(jié)果：
　　1. YWHAZ是microRNA-185-5p的重要功能靶基因。
　　采用四種生物信息學預測軟件（TagetScan、miRanda、CLIP-Seq、miRDB）聯(lián)合預測microRNA-185-5p的功能靶基因，取交集并進行分析，初步確定111個分子為microRNA-185-5p候選功能

7、靶基因；mRNA芯片結(jié)果、i-TRAQ蛋白質(zhì)譜結(jié)果均提示YWHAZ是下調(diào)倍數(shù)最明顯的分子；雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果提示microRNA-185-5p可與YWHAZ mRNA的3’-UTR直接結(jié)合抑制熒光素酶的活性。
　　2.YWHAZ在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細胞系中高表達。
　　qRT-PCR實驗和Western-blotting實驗結(jié)果表明，與結(jié)腸癌低轉(zhuǎn)移細胞系SW480相比YWHAZ在結(jié)腸癌高轉(zhuǎn)移細胞系SW620中表達明顯升高。

8、
　　3. YWHAZ在結(jié)腸癌組織表達高于癌旁組織，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及臨床預后呈相關(guān)性。
　　免疫組織化學染色結(jié)果提示YWHAZ在90例結(jié)腸癌組織標本中，相對于正常癌旁組織，YWHAZ在結(jié)腸癌組織標本中呈陽性表達，統(tǒng)計分析后結(jié)果提示，YWHAZ的陽性表達與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及TNM分期呈顯著相關(guān)性，YWHAZ的陽性表達與患者不良預后呈相關(guān)性。
　　4.YWHAZ可促進結(jié)腸癌細胞EMT表型，促進結(jié)腸癌細胞侵襲遷

9、移能力。
　　利用小干擾RNA技術(shù)下調(diào)YWHAZ在SW620細胞系中的表達，Transwell實驗結(jié)果提示，細胞的侵襲和遷移能力明顯減弱；細胞免疫熒光和Western-blotting實驗結(jié)果提示細胞的EMT表型可被YWHAZ有效逆轉(zhuǎn)；裸鼠尾靜脈注射體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果提示:上調(diào)YWHAZ在SW480細胞系中的表達后，其肝臟轉(zhuǎn)移能力明顯增強。
　　5.YWHAZ與microRNA-185-5p之間負調(diào)控，microRNA-185

10、-5p調(diào)控結(jié)腸癌侵襲遷移及EMT主要是通過作用于靶基因YWHAZ發(fā)揮作用。
　　western-blotting實驗和qRT-PCR實驗結(jié)果提示：在SW480/SW620細胞系中下調(diào)/上調(diào)microRNA-185-5p的表達，YWHAZ的表達明顯上調(diào)/下調(diào);Transwell實驗結(jié)果顯示：microRNA-185-5p調(diào)控結(jié)腸癌侵襲遷移及EMT主要是通過作用于靶基因YWHAZ發(fā)揮作用。
　　結(jié)論：
　　本研究證實了YW