高效靶向調(diào)控突變型Bik基因促淋巴瘤細胞凋亡研究.pdf

1、目的:Bcl-2家族是細胞凋亡中最重要的家族,包括凋亡抑制蛋白Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1等及具有凋亡誘導活性的蛋白Bax、Bad、Bik等,Bcl-2家族蛋白表達異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展相關,并且可能與腫瘤細胞對部分化療藥物的敏感性有關。淋巴瘤細胞中普遍存在Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白的表達水平上調(diào)及Bik等促測亡蛋白的表達下調(diào),一方面使腫瘤細胞對凋亡的敏感性下降,另一方面也可能導致淋巴瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生抵抗

2、。Bik(Bcl-2 interactingkiller)作為Bcl-2家族中的一種僅含BH3結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導蛋白,相對其他凋亡誘導蛋白而言,能結(jié)合的Bcl-2家族凋亡抑制蛋白最多,且與凋亡抑制蛋白中研究最多的Bcl-2及Mcl-1的結(jié)合力最強,是常用的治療基因之一。而將野生型Bik的第33位蘇氨酸殘基和35位絲氨酸殘基替換為門冬氨酸可以模擬這兩個殘基的磷酸化使其成為突變型Bik(BikDD),這種模擬磷酸化可以提高Bik與凋亡抑制蛋白

3、的結(jié)合能力及誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞增殖的能力。
　　 通過轉(zhuǎn)染BikDD(突變型Bik編碼基因)提高淋巴瘤細胞中的Bik表達水平可能是淋巴瘤基因治療的一種有效方法,但外源基因不能在靶部位獲得高效表達是目前腫瘤基因治療面臨的突出問題,本研究著重探討如何實現(xiàn)BikDD在淋巴瘤細胞中的高效特異性表達及研究BikDD表達對淋巴瘤細胞的促凋亡作用。
　　 方法:在研究的第一部分,構(gòu)建出含生存蛋白(Survivin)啟動子、

4、人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因(hTERT)啟動子及巨細胞病毒(CMV)啟動子的熒光素酶表達載體,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)淋巴瘤細胞株Raji、Ramos、Hut78、U937和肝細胞株chang liver,通過檢測熒光素酶表達水平比較不同啟動子在淋巴瘤細胞株中的表達效率與特異性,選擇在淋巴瘤細胞中具有較高效率及特異性的腫瘤特異性啟動子。
　　 第二部分,利用Survivin啟動子與WPRE、TSTA和VISA信號放大系統(tǒng)構(gòu)建出淋巴瘤特異性表達載體

5、S-WPRE、S-TSTA和S-VISA,通過檢測細胞轉(zhuǎn)染后的熒光素酶表達水平比較不同信號放大系統(tǒng)在淋巴瘤細胞株中的表達效率,選擇在淋巴瘤細胞中具有較高效率的放大系統(tǒng)與Survivin組成淋巴瘤特異性高效表達載體。
　　 在第三部分研究中,我們采用淋巴瘤特異性高效表達載體與BikDD治療基因轉(zhuǎn)染淋巴瘤細胞和肝細胞,并測定轉(zhuǎn)染后Bik表達水平,觀察其對淋巴瘤Bik表達的影響及其對淋巴瘤細胞的生長抑制與促凋亡作用。
　　 結(jié)

6、果:(1)Survivin啟動子和hTERT啟動子在淋巴瘤細胞都具有明顯高于陰性對照的活性(p＜0.01)。除在hut78細胞中Survivin啟動子的活性低于hTERT啟動子之外(p＜0.05),Survivin啟動子和hTERT啟動子在淋巴瘤細胞Raji、Ramos、U937細胞中轉(zhuǎn)錄活性無明顯差異(p＞0.05),但Survivin啟動子的淋巴瘤特異性明顯優(yōu)于hTERT啟動子(p＜0.05),故選擇其作為進一步構(gòu)建高效特異性淋巴瘤

7、表達載體的啟動子。(2)S-VISA和S-TSTA在Raji、Ramos、Hut78及U937細胞中的熒光素酶表達水平明顯優(yōu)于pGL3-CMV(p＜0.05),在肝細胞中的熒光素酶表達水平明顯低于pGL3-CMV(p＜0.05),S-VSIA在Raji、Ramos、L1937中的熒光素酶表達水平高于S-TSTA(p＜0.05),分別為655.39％VS315.35％、413.01％VS272.33％、653.92％VS245.00％。而

8、在hut78細胞和chang liver細胞中表達水平無明顯差異(p＞0.05)。故選擇S-VISA作為進一步淋巴瘤促凋亡研究的高效表達載體。(3)我們對于淋巴瘤細胞Bik水平檢測提示四種淋巴瘤細胞的Bik表達水平不同程度地低于肝細胞的Bik水平。S-VISA-BikDD轉(zhuǎn)染后能不同程度提高淋巴瘤細胞的Bik表達水平,并且對于淋巴瘤細胞Raji、Ramos、U937和Hut78具有明顯的生長抑制作用,對淋巴瘤Raji細胞具有促凋亡作用。