小鼠Dectin-1胞外識別區(qū)的融合表達及其識別真菌細胞壁β-葡聚糖的研究.pdf

1、隨著免疫抑制劑的大量使用，臨床上發(fā)生深部真菌感染的患者越來越多，而對這些患者的治療成功與否，很大程度上取決于能否快速檢測出入侵的病原菌。目前，已有大量研究通過檢測體液中真菌抗原或代謝物來快速診斷深部真菌感染，其中以真菌細胞壁成分-β-葡聚糖檢測應用較廣。但由于其易受細菌內(nèi)毒素影響，現(xiàn)行方法存在假陽性高等缺陷，進一步探討具有較高特異性的真菌檢測方法刻不容緩。
　　 β-葡聚糖是真菌細胞壁的保守成分，由β-1，3連接的β-D-葡聚糖

2、構成主鏈，β-1，6連接的葡聚糖隨機散在分布為支鏈所組成，可作為病原相關分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）被機體細胞表面的模式識別受體識別（pattern recognition receptors，PRRs），從而誘導機體免疫反應，產(chǎn)生抗感染等生物效應。因此，β-葡聚糖是與真菌感染相關的生物學標志物。Dectin-1（Dentric cell-associated C-

3、typelectin-1）已被確認為粒細胞上β-葡聚糖的主要受體，為一種Ⅱ型跨膜蛋白，包含一個單獨的細胞外C型凝集素樣糖識別區(qū)域（C-typecarbohydrate recognition domain，CRD）和胞漿內(nèi)的一個免疫受體酪氨酸活化樣基序區(qū)域（immunoreceptor tyrosine-based activation moilf，ITAM），可特異性識別β-1，3連接和β-1，6連接的葡聚糖，甚至整個酵母菌顆粒。本研

4、究擬通過構建小鼠腹腔巨噬細胞Dectin-1 CRD的原核表達載體，進行體外融合表達和親和純化的方法獲得大量Dectin-1CRD融合蛋白；并進一步觀察該可溶性融合蛋白識別常見真菌細胞壁上β-葡聚糖的能力，以評估是否可將其用于真菌感染診斷以提高檢測特異性。本研究共分為以下三個部分：
　　 （一）小鼠Dectin-1融合蛋白原核表達載體的構建與鑒定：以小鼠腹腔巨噬細胞總RNA為模板進行RT-PCR，獲得Dectin-1的細胞外區(qū)域

5、，將其連接到原核表達載體pET28a（+）中，獲得重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1；再通過菌落PCR挑選陽性重組質(zhì)粒進行雙酶切和DNA測序鑒定；結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒pET28-Dectin-1測序結(jié)果與GenBank相應序列（登錄號AF262985）完全吻合，且插入片段讀碼框與表達載體讀碼框相一致。說明含有Dectin-1基因CRD片段的pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒構建成功。
　　 （二）小鼠Dectin-1融合蛋白的

6、表達、純化、復性與鑒定：將pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）表達菌感受態(tài)細胞中，并以空質(zhì)粒pET28a（+）及未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的E.coli BL21（DE3）為對照，在不同的溫度和時間條件下加入IPTG誘導其表達，經(jīng)SDS-PAGE確定融合蛋白表達的最佳條件和形式。研究結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒工程菌表達蛋白于23KD處檢測出特異性陽性信號，即小鼠Dectin-1融合蛋白，且該融合蛋白在包涵體中表達量明顯高于上

7、清可溶性蛋白。結(jié)果提示：pET28-Dectin-1重組質(zhì)粒在E.Coil BL21表達系統(tǒng)中大量表達小鼠Dectin-1融合蛋白，該融合蛋白主要以包涵體形式存在。收集經(jīng)IPTG誘導表達后包涵體蛋白，經(jīng)溶解、純化、復性，即獲得可溶性Dectin-1融合蛋白。
　　 （三）小鼠Dectin-1融合蛋白體外識別常見真菌細胞壁β-葡聚糖的初步研究：采用免疫熒光顯微鏡技術和流式細胞術檢測Dectin-1融合蛋白體外結(jié)合白假絲酵母菌、光滑