Dectin-1在真菌性角膜炎中的作用及其分子機制的初步研究.pdf

1、目的：
　　探討β-葡聚糖特異性識別受體Dectin-1對茄病鐮刀菌及煙曲霉菌的識別及其在正常角膜組織和真菌感染角膜組織中的表達(dá)及特點，并初步探討其在真菌性角膜炎中作用的分子機制。
　　方法:
　　第一部分：真菌刺激對腹腔巨噬細(xì)胞Dectin-1表達(dá)的影響
　　1．小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 C57BL/6小鼠腹腔注射巰基乙酸鈉肉湯（4％），注射后第3天，收集腹腔巨噬細(xì)胞，體外培養(yǎng)24hr，以F4/80抗體及C

2、D68抗體進行鑒定并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞純度。
　　2．真菌刺激對巨噬細(xì)胞模式識別受體Dectin-1表達(dá)的影響利用純化的β-葡聚糖Laminarin、茄病鐮刀菌及煙曲霉菌孢子刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，免疫熒光技術(shù)及RTQ-PCR檢測Dectin-1的表達(dá)變化。
　　第二部分：Dectin-1在小鼠真菌性角膜炎模型中的表達(dá)及特點
　　角膜基質(zhì)注射法建立C57BL/6小鼠茄病鐮刀菌及煙曲霉菌角膜感染模型，角膜基質(zhì)注射生理鹽水

3、小鼠作為陰性對照組，未處理的正常角膜為空白對照組。感染后1、2、3、5、7天取各組角膜行RTQ-PCR檢測，觀察Dectin-1的表達(dá)情況。角膜組織病理學(xué)方法觀察角膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的侵潤，探討侵潤細(xì)胞與Dectin-1表達(dá)量的關(guān)系。
　　第三部分：Dectin-1在真菌性角膜炎中作用分子機制的初步研究
　　1.RTQ-PCR檢測真菌刺激巨噬細(xì)胞及真菌感染的角膜中CARD9的表達(dá)；
　　2.RTQ-PCR檢測主要細(xì)胞因子及趨

4、化因子IL-1β、IL-2、IL-6、MIP-2、IL-10、IL-12、IL-17、MCP-1、TNF-α、CXCL1/KC在Laminarin刺激細(xì)胞及真菌感染角膜中的表達(dá)；
　　3.Dectin-1多克隆抗體阻斷體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1，再利用茄病鐮刀菌及煙曲霉菌刺激細(xì)胞，檢測Dectin-1抗體阻斷前后細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β的含量。
　　結(jié)果:
　　第一部分：真菌刺激對腹腔巨噬細(xì)胞Decti

5、n-1表達(dá)的影響
　　小鼠腹腔注射巰基乙酸鈉肉湯3天后，每只小鼠腹腔大約可收集1×107個細(xì)胞。體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞貼壁生長，呈圓形、長形及不規(guī)則三角形等，可見突觸。F4/80抗體免疫熒光染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測，可發(fā)現(xiàn)F4/80陽性細(xì)胞約占86％，說明此方法分離的腹腔巨噬細(xì)胞純度較高，可以進行相關(guān)的功能性研究。
　　真菌刺激后巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1表達(dá)上調(diào)。Laminarin與培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞共同孵育12hr后，RTQ-

6、PCR結(jié)果顯示Dectin-1的表達(dá)并未升高（P=0.261）。而茄病鐮刀菌孢子和煙曲霉菌孢子與細(xì)胞以1：10的比例共同孵育12hr后，受真菌刺激的細(xì)胞Dectin-1的表達(dá)則明顯上調(diào)（P=0.000&P=0.009）。
　　第二部分：Dectin-1在小鼠真菌性角膜炎模型中的表達(dá)及特點
　　RTQ-PCR結(jié)果及Dectin-1免疫熒光染色的結(jié)果均顯示，正常及陰性對照角膜組織中沒有Decitin-1的表達(dá)。但是在真菌感染的角

7、膜中，可以檢測到Dectin-1的表達(dá)。Dectin-1的表達(dá)量與炎癥細(xì)胞侵潤程度緊密相關(guān)，在感染后的第2、3天，感染角膜組織內(nèi)炎癥細(xì)胞侵潤最為明顯，同時Dectin-1的表達(dá)水平也最高。隨著病程的進展，炎癥細(xì)胞的數(shù)量減少，Dectin-1的表達(dá)量也隨之下降。對侵潤的炎癥細(xì)胞進行F4/80和Gr-1免疫熒光染色，結(jié)果則顯示，侵潤的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞表達(dá)Dectin-1。
　　第三部分：Dectin-1在真菌性角膜炎中作用分子機制

8、的初步研究
　　真菌感染的角膜中,CARD9的表達(dá)明顯上調(diào)，其上調(diào)趨勢與Dectin-1一致。腹腔巨噬細(xì)胞表面Dectin-1對β-葡聚糖的識別和清除過程中，可介導(dǎo)IL-1β、MIP-2、IL-12、CXCL1/KC、MCP-1等多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)最明顯的為IL-1β、IL-12和IL-6。在兩種絲狀真菌的角膜炎模型中，也均可觀察到上述細(xì)胞因子的表達(dá)明顯上調(diào)，其中表達(dá)上調(diào)最顯著的細(xì)胞因子為IL-1β、MIP-2、CXCL1/

9、KC和IL-12.其上調(diào)及下調(diào)的變化趨勢與Dectin-1及CARD9變化趨勢一致。Dectin-1抗體中和實驗顯示：中和抗體阻斷Dectin-1后，煙曲霉菌孢子與細(xì)胞共孵育24hr后，IL-1β的表達(dá)量下降(P=0.016)。
　　結(jié)論:
　　1、茄病鐮刀菌和煙曲霉菌可激活腹腔巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1。
　　2、正常的小鼠角膜組織不表達(dá)Dectin-1，但受真菌感染的角膜組織有Dectin-1的表達(dá)。
　

10、　3、FK小鼠角膜中，Dectin-1的表達(dá)量與炎癥細(xì)胞的侵潤程度相關(guān)。
　　4、CARD9在FK中表達(dá)上調(diào)，說明其介導(dǎo)的信號通路可能參與了FK的發(fā)病過程。
　　5、Dectin-1識別β-葡聚糖后，可誘導(dǎo)IL-1β、MIP-2、KC、IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生；茄病鐮刀菌與煙曲霉菌發(fā)病過程中細(xì)胞因子的產(chǎn)生及表達(dá)變化趨勢一致。
　　6、采用特異性的Dectin-1多克隆抗體中和巨噬細(xì)胞表面的Dectin-1，可以部分阻