白念珠菌細(xì)胞壁中β(1-3)-葡聚糖通過ERK信號通路激活小鼠樹突狀細(xì)胞.pdf

1、研究背景:現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步與科技發(fā)展，在給我們帶來醫(yī)學(xué)治療的新手段（如器官移植、腫瘤的放化療、免疫抑制劑的應(yīng)用增加等）的同時(shí)，也引起了一系列的不良事件的發(fā)生，而受害者往往也主要是這些免疫缺陷患者。其中，構(gòu)成對免疫缺陷宿主威脅最大的3種機(jī)會(huì)性致病真菌，分別為:煙曲霉、白念珠菌和新生隱球菌。而在這3種機(jī)會(huì)性致病真菌中，白念珠菌又是最為常見的機(jī)會(huì)性致病菌，其主要分布于多種組織器官的機(jī)會(huì)性致病菌，包括口腔、胃腸道、陰道黏膜和皮膚表面等。白念珠菌細(xì)

2、胞壁在其致病感染和免疫的過程中具有非常重要的作用。白念珠菌細(xì)胞壁的主要成分為多糖，其中含量最多的為葡聚糖。白念珠菌細(xì)胞壁的葡聚糖可以通過樹突狀細(xì)胞的表面的受體來誘導(dǎo)宿主機(jī)體的固有免疫和適應(yīng)性免疫。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)是聯(lián)系固有免疫和適應(yīng)性免疫之間的樞紐，負(fù)責(zé)感受和監(jiān)測外界環(huán)境，啟動(dòng)宿主免疫反應(yīng)并指導(dǎo)適當(dāng)?shù)目共≡w適應(yīng)性免疫反應(yīng)的進(jìn)行。樹突狀細(xì)胞表面的模式識別受體（Pattern recognition r

3、eceptors，PRRs），包括Toll-樣受體、C-型凝集素受體，它們能夠直接識別并結(jié)合微生物上高度保守的分子結(jié)構(gòu)（如白念珠菌細(xì)胞壁上的葡聚糖等），進(jìn)而發(fā)揮免疫作用。例如，C-型凝集素受體如Dectin-1通過識別真菌表面的β-葡聚糖，進(jìn)而識別多種真菌的感染，包括念珠菌、隱球菌、曲霉菌，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。機(jī)體通過識別白念珠菌細(xì)胞壁及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行不同的免疫反應(yīng)應(yīng)答，由于T細(xì)胞在免疫應(yīng)答中處于核心地位，而DC又是目前已知的唯一

4、可以活化的初始輔助性T細(xì)胞的專職抗原提呈細(xì)胞，因此，研究DC對白念珠菌的抗感染免疫反應(yīng)就顯得尤為重要。因此本研究初步探討白念珠菌壁中的成分(β(1-3)-葡聚糖）對小鼠樹突狀細(xì)胞免疫應(yīng)答的機(jī)制。
　　材料與方法:細(xì)胞:小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4細(xì)胞系;菌株:白念珠菌(ATCC11006)。材料與方法:1.細(xì)胞培養(yǎng):1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素、0.25％胰蛋白酶、二甲基亞砜(DMSO)、PBS緩沖液等。2.RNA提取及測定:

5、Trizol裂解液、氯仿、異丙醇、RNAase-free水、ddH2O等。3.總蛋白提取及測定:RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA試劑盒等。4.RT-PCR: GAPDH引物、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑盒等。5.Western blot:兔抗小鼠GAPDH抗體、兔抗小鼠IL-2、6、8抗體、兔抗小鼠ERK、p-ERK抗體、兔抗小鼠caspase8抗體、兔抗小鼠CDK2抗體、兔抗小鼠cyclin-A抗體、山羊抗兔IgG、SDS-PAGE

6、凝膠配制試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、10×TBST、甘氨酸、Trizma base、SDS等。6.流式細(xì)胞術(shù):PBS緩沖液、無水乙醇、PI試劑盒、FITC試劑盒。
　　結(jié)果:在β(1-3)-葡聚糖的作用下，DC2.4細(xì)胞內(nèi)的促炎因子IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)量增加，且在一定的濃度范圍內(nèi)，隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加IL-2、IL-6、IL-8的mRNA表達(dá)量也增加，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

7、(P＜0.05)。且用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖的作用下DC2.4細(xì)胞內(nèi)的IL-2、IL-6、IL-8的蛋白表達(dá)水平與mRNA的表達(dá)水平結(jié)果一致。在β(1-3)-葡聚糖的作用下，細(xì)胞S期增加，促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程，且在一定范圍內(nèi)隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加，細(xì)胞S期增加，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且加入ERK信號通路抑制劑PD98059，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因加入白念珠菌β(1-3)

8、-葡聚糖而引起的S期細(xì)胞的增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路關(guān)鍵蛋白及其下游周期相關(guān)蛋白因子的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)的變化。在β(1-3)-葡聚糖的作用下，DC2.4細(xì)胞的凋亡數(shù)量明顯減少，且在一定范圍內(nèi)隨著β(1-3)-葡聚糖濃度的增加，細(xì)胞凋亡減少，具有濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。且加入ERK信號通路抑制

9、劑PD98059，發(fā)現(xiàn)其可以逆轉(zhuǎn)細(xì)胞因加入白念珠菌β(1-3)-葡聚糖而引起的抑制細(xì)胞凋亡，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。用Western blot的方法檢測在β(1-3)-葡聚糖和PD98059的作用下DC2.4細(xì)胞內(nèi)ERK信號通路關(guān)鍵蛋白及其下游凋亡相關(guān)蛋白因子的表達(dá)也發(fā)生相應(yīng)的變化。
　　結(jié)論:白念珠菌細(xì)胞壁中β(1-3)-葡聚糖可促進(jìn)DC2.4細(xì)胞炎癥因子IL-2、IL-6、IL-8的表達(dá)。白念珠菌細(xì)胞壁中β(1-3