重組人IL-31高效表達(dá)、純化及致小鼠皮膚炎癥的研究.pdf

1、目的：探索最佳的重組人IL～31的高效表達(dá)條件，獲得高純度的重組蛋白，并用獲得的rhIL-31致小鼠皮膚炎癥，探討rhIL-31與皮膚炎癥的直接相關(guān)性及其作用機(jī)制。 方法：（1）培養(yǎng)工程菌株E．coli BL21（DE3），SDS-PAGE分析不同誘導(dǎo)劑濃度、不同誘導(dǎo)溫度、不同誘導(dǎo)時(shí)間的條件下重組蛋白表達(dá)量，探索適宜的表達(dá)條件。（2）溶菌酶結(jié)合超聲波處理破碎細(xì)菌，去垢劑洗滌雜蛋白，溶解包涵體，用sephadex G-75和Ni-

2、NTA瓊脂糖凝膠FF柱分別純化rhIL-31溶包液，SDS-PAGE分析純化效果， Western blot、氨基酸序列分析鑒定rhIL-31。（3）純化產(chǎn)物進(jìn)行透析濃縮，測(cè)定濃縮后蛋白濃度。（4）用獲得的復(fù)性后rhIL-31蛋白以10μg、20μg、40μg三種不同劑量對(duì)Balb/C小鼠進(jìn)行皮下注射和肌肉注射，并設(shè)相應(yīng)途徑對(duì)照組，觀察其皮膚和行為變化，體重和外周血白細(xì)胞變化；注射10天后取皮損部位皮膚作石蠟切片并進(jìn)行HE染色，觀察皮膚

3、組織的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，同時(shí)收集血清，檢測(cè)小鼠血清中IL-6，IL-8，MIP-3β和L選擇素等炎性細(xì)胞因子水平。 結(jié)果：（1）SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，IPTG濃度為1．0 mmol/L，溫度37℃左右，誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高。（2）sephadex G-75目的蛋白和雜蛋白同時(shí)沈脫；Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化蛋白包涵體溶解液50mM咪唑沈脫雜蛋白，100mM、200mM咪唑洗脫目的蛋白。（3）Westernblot可見(jiàn)

4、目的蛋白約34kd處有特異性蛋白條帶；氨基酸序列分析證實(shí)，我們獲得的重組蛋白與人IL-31氨基酸序列一致。（4）注射rhIL-31的小鼠出現(xiàn)頻繁的搔抓行為，有脫毛現(xiàn)象，小鼠體重增幅降低；外周血白細(xì)胞總數(shù)增加，中性粒細(xì)胞顯著增高，有一定的劑量依賴(lài)性。（5）小鼠皮膚病理HE染色可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，深達(dá)肌層，受損皮膚組織出現(xiàn)棘層肥厚，高劑量實(shí)驗(yàn)組可見(jiàn)肌肉溶解。（6）兩種注射途徑與其對(duì)照組比較，小鼠血清細(xì)胞因子IL-6、IL-8、L-選擇素和

5、MIP-3β水平均有顯著增高（p<0．05），并且隨IL-31劑量的增加而增高，具有劑量依賴(lài)性；皮下注射實(shí)驗(yàn)組IL-6、L-選擇素和MIP-3β水平略低于肌肉注射實(shí)驗(yàn)組，IL-8水平接近。 結(jié)論：（1）IPTG濃度為1．0mmol/L，溫度37℃左右，誘導(dǎo)5h蛋白表達(dá)量最高。（2）用和Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱純化rhIL-31效果優(yōu)于sephadex G-75。（3）注射rhIL-31的小鼠體重增幅降低，有頻繁的搔抓行為，可