穩(wěn)定消減MK5增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、肝癌和胰腺癌均為臨床上最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，它們的惡性程度高、發(fā)展進(jìn)程快、轉(zhuǎn)移性強(qiáng)、死亡率高。由于肝癌及胰腺癌發(fā)病初期癥狀隱匿、有效的早期檢測(cè)方法匱乏，當(dāng)患者出現(xiàn)明顯癥狀并確診時(shí)，病情往往已經(jīng)發(fā)展至中晚期。手術(shù)切除是肝癌及胰腺癌治療的最佳方案，但是在手術(shù)切除方案不能施行的情況下，化學(xué)藥物療法成為了主要的治療手段。
　　阿霉素是臨床常用的肝癌治療藥物，曾被認(rèn)為是最有效的肝癌化療藥物之一。然而，阿霉素除具有較強(qiáng)的心臟毒性作用外，也

2、面臨著日益嚴(yán)重的肝癌細(xì)胞耐藥性導(dǎo)致的療效下降的難題。而胰腺癌的5年生存率僅為5％，其中胰腺導(dǎo)管癌約占胰腺癌總數(shù)的75％-92％，因此，胰腺導(dǎo)管癌是胰腺癌研究的重點(diǎn)。尤為突出的是，臨床上專門用于治療胰腺導(dǎo)管癌的藥物相對(duì)較少，對(duì)其他腫瘤有效的藥物在胰腺導(dǎo)管癌治療中往往難以奏效。
　　本研究的第一部分主要探討MK5在阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡中的作用。MAPKAPK5(MK5)，又名p38調(diào)節(jié)/激活的蛋白激酶(p38-regulated/

3、activated proteinkinase，PRAK)。盡管有實(shí)驗(yàn)證據(jù)提示MK5的mRNA水平在正常肝組織與肝癌組織中存在差異，但MK5與肝癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制的關(guān)系卻并不明確。本研究中，我們首先比較了MK5在人肝癌及其癌旁組織樣本中的蛋白含量，結(jié)果顯示，MK5蛋白在肝癌樣本中呈高豐度表達(dá)。隨后，我們采用基因擾動(dòng)的方式，分別在肝癌細(xì)胞株HepG2及Hep3B中構(gòu)建了過(guò)量表達(dá)MK5的穩(wěn)定細(xì)胞株，以及消減內(nèi)源MK5的穩(wěn)定細(xì)胞株。結(jié)果顯示，MK

4、5蛋白表達(dá)水平的變化對(duì)肝癌細(xì)胞在正常培養(yǎng)條件下的細(xì)胞周期及增殖速率無(wú)顯著影響。但是，過(guò)量表達(dá)MK5能夠提高肝癌細(xì)胞在阿霉素處理?xiàng)l件下的存活率，而消減內(nèi)源MK5表達(dá)能夠降低阿霉素處理下的肝癌細(xì)胞存活率。過(guò)量表達(dá)或消減內(nèi)源MK5對(duì)其他化療藥物（如喜樹堿、長(zhǎng)春新堿及紫杉醇）處理?xiàng)l件下肝癌細(xì)胞株的存活能力沒(méi)有影響。進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，MK5能夠通過(guò)蛋白酶體降解，其過(guò)程能夠被阿霉素所促進(jìn)。此外，過(guò)量表達(dá)MK5能夠削弱阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的凋亡，

5、而消減內(nèi)源MK5能夠增加肝癌細(xì)胞對(duì)阿霉素處理的敏感性（肝癌細(xì)胞凋亡率約增加25％-40％）。
　　本文的第二部分是尋找和探討治療胰腺癌的藥物靶標(biāo)。腦特異性表達(dá)激酶2(Brain-specific kinase2，BRSK2)是AMPK(AMP-activated protein kinase)家族成員之一。本實(shí)驗(yàn)室早期工作證實(shí)，BRSK2蛋白在胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞PANC-1以及胰腺導(dǎo)管癌組織中高豐度表達(dá)，它是PANC-1細(xì)胞耐受惡劣環(huán)

6、境（如糖饑餓）的重要因子。因此，BRSK2是潛在的胰腺導(dǎo)管癌治療靶標(biāo)，而尋找BRSK2調(diào)控機(jī)制對(duì)胰腺導(dǎo)管癌治療也具有重要意義。本研究中，我們通過(guò)酵母雙雜交方式，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的與BRSK2相互作用的蛋白Jab1(c-Jun activation domain-binding protein-1)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，Jab1能夠促進(jìn)多個(gè)蛋白通過(guò)泛素蛋白酶體途徑降解，此外，Jab1也能夠參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控。我們首先對(duì)BRSK2及Jab1在多種腫

7、瘤細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，Jab1在腫瘤細(xì)胞株中廣泛表達(dá)，而BRSK2僅在胰腺導(dǎo)管癌PANC-1細(xì)胞中高豐度表達(dá)，在HeLa細(xì)胞及HEK293T細(xì)胞中有少量的表達(dá)。通過(guò)GST pull-down及免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，我們證實(shí)了BRSK2與Jab1能夠在體外及生理水平相互結(jié)合。免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BRSK2與Jab1在細(xì)胞內(nèi)存在共定位現(xiàn)象。我們證實(shí)了Jab1能夠提高BRSK2的體內(nèi)泛素化水平并且促進(jìn)BRSK2蛋白通

8、過(guò)蛋白酶體降解。此外，外源表達(dá)BRSK2能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯在G2/M期，而外源過(guò)量表達(dá)Jab1可以逆轉(zhuǎn)BRSK2誘導(dǎo)的G2/M期阻滯。
　　綜上所述，我們的研究第一次發(fā)現(xiàn)MK5蛋白在肝癌組織中呈現(xiàn)高豐度表達(dá)，我們證實(shí)了穩(wěn)定消減MK5能夠增強(qiáng)阿霉素誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞凋亡。另一方面，我們發(fā)現(xiàn)了胰腺導(dǎo)管癌中高豐度表達(dá)蛋白BRSK2的一個(gè)新的互作分子Jab1并證實(shí)Jab1能夠促進(jìn)BRSK2通過(guò)蛋白酶體降解。本項(xiàng)研究為肝癌細(xì)胞株阿霉素耐藥