Calpain家族對(duì)肝癌細(xì)胞耐受阿霉素促凋亡作用及遷移能力的影響.pdf

1、目的：觀察阿霉素（ADM）作用下肝癌細(xì)胞（HepG2）鈣激活中性蛋白酶（Calpain）家族的促凋亡作用和表達(dá)水平的影響，以及Calpain家族對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)肝癌發(fā)生的分子機(jī)制，為臨床肝癌的防治提供依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分：Calpain家族對(duì)肝癌細(xì)胞耐受ADM促凋亡作用的影響
　　采用人HepG2肝癌細(xì)胞系為模型細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)；通過MTT法觀察ADM對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的抑制效應(yīng)；通

2、過蛋白免疫印跡法（Western blot）分析ADM對(duì) HepG2肝癌細(xì)胞 Calpain-1及 Calpain-2表達(dá)水平的影響；采用 Calpain-2抑制劑 Calpastatin peptide預(yù)處理模型細(xì)胞，觀察 Calpastatin peptide對(duì)ADM誘導(dǎo)HepG2肝癌細(xì)胞凋亡及Calpain-2、Src表達(dá)水平的影響。
　　第二部分：Calpain家族對(duì)肝癌細(xì)胞遷移能力的影響
　　采用人肝細(xì)胞來源的5株

3、細(xì)胞系HepG2、MHCC97-H、Changliver、Hep3B2.1.7、LM3為模型細(xì)胞，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)；通過 Western blot法分析不同轉(zhuǎn)移能力肝細(xì)胞系中 Calpain-1、Calpain-2、Calpastatin及 Src的表達(dá)水平；采用Calpastatin peptide預(yù)處理模型細(xì)胞MHCC97-H，通過劃痕實(shí)驗(yàn)觀察高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H的遷移能力；并采用Western blot法分析Calpasta

4、tin peptide對(duì)MHCC97-H細(xì)胞的Calpain-1、Calpain-2、Src表達(dá)及剪切活性。
　　結(jié)果：
　　第一部分
　?。?） ADM對(duì)HepG2細(xì)胞有明顯的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度為2.5μmol/L；
　?。?） ADM對(duì)HepG2細(xì)胞Calpain-1及Calpain-2表達(dá)的影響均表現(xiàn)為先降低（0.5h，1h，4h）后升高（12h，24h，48h，72h），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其相應(yīng)的低分子

5、量片段（LMW）也呈現(xiàn)出先降低（0.5h，1h，4h）后升高（12h，24h，48h，72h）的變化，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　（3） Calpain-2抑制劑Calpastatin peptide促進(jìn)ADM對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，與只用Calpastatin peptide的HepG2細(xì)胞組比較P<0.05或P<0.01；且Calpastatin peptide抑制ADM處理組及非處理組對(duì)Calpain-2及Src表達(dá)的上調(diào)。

6、
　　第二部分
　?。?）不同轉(zhuǎn)移能力的肝細(xì)胞系中，Calpain-1的表達(dá)及相應(yīng) LMW產(chǎn)生變化不大；Calpain-2及 Calpastatin的表達(dá)在兩株高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系（MHCC97-H、LM3）中明顯上調(diào)，其剪切成為LMW也明顯增多；Src在兩株高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞系（MHCC97-H、LM3）中的表達(dá)明顯增高，尤其在MHCC97-H細(xì)胞中；
　?。?）Calpain-2抑制劑 Calpastatin peptid

7、e明顯抑制高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H的遷移；
　?。?）Calpastatin peptide使高轉(zhuǎn)移肝癌細(xì)胞MHCC97-H Calpain-2及Src的表達(dá)下調(diào)，Calpain-1的表達(dá)沒有明顯變化。
　　結(jié)論：
　?。?）ADM長時(shí)間(12-72h)作用下，促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)Calpain-1和Calpain-2的表達(dá)，相應(yīng)的低分子量片段也增加。
　?。?）Calpain-2的表達(dá)上調(diào)和低